Sirt1在糖尿病视网膜病变中的功能及活血解毒方干预机制的研究

Diabetic Retinopathy is one of the most common complications of diabetes，its pathogenesis has not been fully elucidated.Previous research found that Sirt1 gene plays a crucial role in repairing injured DNA and extending the life of cells， while reports on the interacting relationship between Sirt1 and apoptosis of diabetic retinopathy are rare. Preliminary experiments of our project team revealed that Sirt1 were decreased in retinal tissue of diabetic rats and Huoxue Jiedu formula could improve the diabetic retinopathy and reduce the degree of apoptosis and the expression of relevant cell factors.Therefore, this research will use gene recombination technology to looks into the improvements of mice diabetic retinopathy and the apoptosis of retinal ganglion cells on high-glucose，and also the expression of p53, FOXO3 after enhancing or suppressing the expression of exogenous Sirt1, by producing overexpression and silencing Sirt1 vectors (through DNA restructuring and siRNA technologies).Meanwhile, this research also watch the expression of Sirt1 and other related cytokines on the basis of Huoxue Jiedu formula treatment in vivo and in vitro, in order to clarify the mechanism of Huoxue Jiedu formula to improve diabetic retinopathy.This research aims to explore in greater depth the efficacy of Huoxue Jiedu formula and provide practical basis for its clinical application.

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的并发症之一，其发病机制尚未完全阐明，既往研究证实Sirt1基因在DNA损伤修复、延长细胞寿命中发挥重要作用，但Sirt1与糖尿病视网膜病变的关系鲜有报道。项目组前期研究发现糖尿病大鼠视网膜组织中Sirt1的表达下降，细胞凋亡增加，活血解毒方能改善糖尿病大鼠视网膜病变，降低细胞凋亡及相关细胞因子的表达。本研究利用基因重组技术构建Sirt1过表达和沉默两种载体，观察外源性Sirt1表达增强或抑制后对糖尿病大鼠视网膜病变和高糖培养原代视网膜神经节细胞的影响，并检测Sirt1下游p53、FOXO3等细胞因子的表达水平。同时观察活血解毒方在整体和细胞水平干预后Sirt1及其下游相关分子的表达水平，从而阐明活血解毒方改善糖尿病视网膜病变的分子机制。本研究旨在探索Sirt1在糖尿病视网膜病变中的功能及活血解毒方的药效机理，为其临床应用提供实验依据和理论基础。

sirt1基因在DNA损伤修复、延长细胞寿命中发挥重要作用，本项目通过构建sirt1过表达和沉默两种载体，观察外源sirt1表达增强或抑制后对高糖培养原代视网膜神经节细胞的影响。活血解毒方是临床经验方，具有活血化瘀、清热解毒的功效，基于sirt1信号通路的研究，本项目继续构建糖尿病大鼠模型，从整体、细胞和分子水平观察活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜病变的干预作用及其分子机制。结果：（1）成功构建了大鼠sirt1过表达慢病毒pLV5-sirt1，能够增加sirt1mRNA和蛋白在视网膜神经节细胞的表达（P＜0.05）。（2）成功构建sirt1的小干扰RNA慢病毒载体pLV3-si-sirt1，能够减少视网膜神经节细胞中sirt1mRNA和蛋白的表达。（3）将pLV5-sirt1和pLV3-si-sirt1感染高糖培养下的视网膜神经细胞，CCK8结果显示，pLV5-sirt1组细胞的活性明显增加，而pLV3-si-sirt1干扰组的细胞活性下降，两组与高糖组相比有显著性差异（P＜0.05）。Annexin-V/PI检测结果发现，pLV5-sirt1能够显著抑制高糖培养下视网膜神经节细胞的凋亡，pLV3-si-sirt1能够协同增加细胞的凋亡率（P＜0.05）。（4）Western blot显示，pLV5-sirt1能够显著降低视网膜神经节细胞中p53、FOXO3a、NF-κBp65和caspase-3的蛋白的表达。而pLV3-si-sirt1能够显著增加细胞中p53和caspase-3的蛋白的表达（P＜0.05）。（5）给予糖尿病大鼠活血解毒方能够明显升高暗适应眼最大电反应a波、b波和OPs振幅值，与模型组相比有显著性差异（P＜0.05）。（6）HE染色和TUNEL结果显示，活血解毒方能够改善糖尿病大鼠视网膜组织病变，减少凋亡细胞数。（7）活血解毒方能够显著降低糖尿病大鼠视网膜NF-κB和Caspase-3蛋白及mRNA的表达。同时，活血解毒方能够显著上调sirt1的表达，降低p53的表达（P＜0.05）。（8）活血解毒方含药血清能够增加高糖干预下的视网膜神经节细胞的活性，降低视网膜神经节细胞的凋亡率。本项目通过sirt1信号通路研究活血解毒方对糖尿病视网膜病变的保护作用及相关机制，揭示活血解毒方对糖尿病视网膜病变药效和作用靶点，以期为其临床应用提供更加完备的实验数据支持。