基于蛋白质组学的大黄鱼肌肉蛋白质自由基氧化机制研究

For many years, lipid oxidation and microbial activities have been considered to be the major causes of food spoilage, while the contribution of protein oxidation has been neglected. Recent studies have shown that protein oxidation was an important deteriorative factor in food processing and storage, since it can change the structure and function of protein. However, the knowledge about protein oxidation in foods was still limited, and we know very little about the mechanism of protein oxidation in fish muscle. In this project, protein oxidation in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea), an important marine-cultured fish in China, will be studied. Fluorescent labeling combined with proteomic techniques to identify oxidized proteins in fish muscle will be firstly developed. Fish muscle samples suffered auto oxidation in vivo and treated in various free radicals-catalyzed oxidation systems in vitro will be analyzed by proteomic techniques to identify the types and the functions of the oxidized proteins. Furthermore, modern chromatographic and spectroscopic techniques, such as High Pressure Liquid Chromatography with Fluorescence Detection (HPLC-FLD), Fourier-transform Infrared Spectroscopy (FT-IR), Differential Scanning Calorimetry (DSC), and Scanning Electron Microscopy (SEM), will be employed to characterize the properties of protein oxidation and the morphology of oxidized myofibrillar proteins in fish muscle. The aim of this work is to clarify the mechanism of protein oxidation in fish muscle and find the basic reason of fish spoilage, which can provide new theoretical basis for the control of seafood quality. The study will contribute to improving the theories and technologies of seafood storage and processing, and reducing the economic losses caused by spoilage.

一般认为脂质氧化和微生物作用是导致食品腐败的主要原因，而蛋白质氧化作用一直被忽视。近期研究表明，蛋白质氧化能导致蛋白质结构和功能发生变化，成为影响食品品质的又一重要因素。但目前人们对食品中蛋白质氧化的认识仍比较有限，尤其对鱼肉中蛋白质氧化机制知之甚少。鉴于此，本项目拟以我国重要的海水养殖鱼类--大黄鱼为研究对象，建立其肌肉氧化蛋白质的荧光差异蛋白质组学研究平台，利用该平台系统研究大黄鱼肌肉在体内氧化和体外不同自由基模拟氧化体系中参与氧化的主要蛋白质及其功能，并结合HPLC-FLD、FT-IR、DSC、SEM等现代色谱和光谱手段细致表征大黄鱼肌肉蛋白质的氧化规律及肌原纤维蛋白氧化后的结构信息，阐明大黄鱼肌肉蛋白质的氧化途径和机制，深层次揭示鱼肉品质衰败的根本原因。本研究可为鱼类等水产品品质调控提供新的理论依据，对丰富水产品加工基础理论、提高水产品保鲜水平、减少经济损失等具有重要意义。

为阐明大黄鱼肌肉蛋白质氧化的途径和机制，深层次揭示鱼肉品质衰败原因，本项目采用荧光素-5-氨基硫脲（FTSC）对氧化肌肉蛋白质进行标记，建立了基于荧光标记的肌肉氧化蛋白质双向电泳技术体系，获得了分离度好、分辨率高的双向电泳图谱，为分离鉴定氧化蛋白质、解析蛋白质氧化机制奠定了基础。利用荧光差异蛋白质组学技术平台研究了大黄鱼肌肉在4℃贮藏过程种体内氧化和羟自由基、丙烯醛体外模拟氧化体系中肌肉蛋白质的氧化情况，鉴定出参与氧化的主要蛋白质并分析了其生物学功能，发现被氧化的蛋白质主要是肌原纤维蛋白组分和一些参与肌肉糖酵解代谢的酶类，为阐明大黄鱼肌肉蛋白质氧化机制提供了重要证据。研究了大黄鱼在4℃冷藏、-18℃与-80℃冻藏过程中肌肉蛋白质的氧化规律，发现贮藏过程中肌原纤维蛋白与肌浆蛋白均发生了一定程度的氧化，表现为羰基含量、二聚酪氨酸含量和表面疏水性显著增加，巯基、游离氨基和有效赖氨酸含量减少；同时肌纤维结构逐渐被破坏，肌肉持水力逐渐降低，自由水含量明显增多；肌原纤维蛋白的凝胶强度、凝胶白度、凝胶持水性、乳化活性和乳化稳定性均有所下降。采用不同浓度羟自由基与超氧阴离子自由基、烷过氧自由基、丙二醛、丙烯醛和HPODE分别对鱼肉和提取的肌原纤维蛋白进行体外模拟氧化，分析肌原纤维蛋白质在自由基直接氧化和脂质氧化引起的间接氧化时结构和性质的变化规律，发现模拟氧化处理会破坏肌纤维结构，降低肌肉持水力；同时影响肌原纤维蛋白结构和功能性质，使羰基和二聚酪氨酸含量增加，巯基、游离氨基、有效赖氨酸含量、内源荧光强度降低，蛋白质结构发生显著变化，表面疏水性显著增大，并发生降解和聚集，热稳定、溶解性、凝胶性、乳化性及乳化稳定性能降低，且氧化剂浓度越大氧化效应越显著。综上，大黄鱼肌肉蛋白质通过自由基直接作用，或通过脂质氧化产物的间接作用下发生氧化，导致其结构和功能性质发生变化，进而使肌肉品质发生变化。