microRNA在微囊藻毒素抑制哺乳动物造血功能中的作用机制

Water eutrophication caused cyanobaterial blooms, then a variety of cyanotoxins were released to water by cyanobacteria cells which have caused a great threat to the ecological environment and human health. Among cyanotoxins, the microcystins (MCs) are the most common and toxic group. Previous studies have shown MCs are hepatotoxicity, renal toxicity, immune toxicity, reproductive toxicity, developmental toxicity and potential cancer-promoting activity. There were some studies about anemia caused by MC-LR which are concentrated in the hematological indices, the proliferation of bone marrow cells, genetic toxicity and so on, but the mechanism research about inhibition of hematopoietic function is still unclear. In this study, we observe the anemia and related physiological、pathological changes, using traditional toxicological methods by mice anemic model and cell toxicological model when the mice ( bone marrow stromal cell ) exposed to MC-LR. Firstly, we reveal the variation of mice microRNA expression level by genomics technique and bioinformatics analysis. Then we evaluate the variation of bone marrow stromal cell protein expression level by proteomics technique. Eventually, we clarify the molecular mechanisms of microRNA in inhibition of hematopoietic function when mammalian exposed to microcystin-LR, so as to provide more trial evidence for epidemiological studies, risk assessment and safety management.

水体富营养化引起水体大规模暴发蓝藻水华，蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种有毒的藻毒素，而微囊藻毒素（Microcystin, MC）是其中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的一类。已有的研究证实MC具有多器官毒性效应，能造成机体贫血，骨髓细胞增殖活力下降并引起遗传毒性，但是对于其抑制动物造血功能的分子机理目前尚不明确。本项目通过建立小鼠贫血动物模型和骨髓基质细胞毒理模型，采用传统毒理学方法观察MC染毒后致其发生贫血效应和相关的生理学、病理学变化。并首次结合现代毒理学方法，采用基因组学、生物信息学的分析方法揭示小鼠microRNA表达变化规律、利用蛋白质组学技术揭示MC对小鼠骨髓基质细胞蛋白质表达的变化规律，最终阐明microRNA在微囊藻毒素抑制哺乳动物造血机能中的作用及其分子机制，从而为流行病学研究提供更丰富的试验证据，为风险评估和安全管理提供更直接和可参考的实验证据。

本课题通过建立动物贫血模型和细胞毒理模型，结合传统毒理学和现代毒理学方法，探讨MC-LR抑制动物造血功能的分子机制。（1）通过对Wistar大鼠连续腹腔注射两个不同剂量MC-LR 50d后，RBC、Ht、Hb含量均显著下降；WBC显著上升。骨髓细胞周期表明MC-LR显著抑制了细胞从G1到S期的进程，并在高剂量组显著促进细胞凋亡率上升。Bcl-2 mRNA表达水平显著下调；Bax 、p53、caspase-3、Fas、Fas-L mRNA表达水平显著上调。（2）通过对balb/c小鼠连续腹腔注射两个不同剂量MC-LR 30d后，RBC、Ht、Hb均显著下降；WBC显著上升，成功建立小鼠贫血模型。股骨中骨髓出现大量脂肪泡，有核细胞增生程度减低，骨髓造血功能呈重度抑制状态。脾脏中红髓、白髓界限不清，淋巴细胞数量明显减少，淋巴组织出现萎缩，说明其造血、免疫功能受到抑制。骨髓细胞凋亡率显著增加，呈现剂量-效应关系。骨髓细胞中GM-CSF、EPO和IL-3 mRNA表达水平显著下调；而TNF-α mRNA表达水平显著上调。小鼠肝脏和脾脏中MDA含量水平显著上升，说明其受到了氧化损伤。抗氧化物质GSH含量显著降低；抗氧化酶GPX活力显著升高，SOD活力显著降低。由于取骨髓样品没有全面考虑micRNA降解风险，和我自身原因（计划外有孕），造成micRNA提取质量不合格，无法准确建文库，最终骨髓细胞micRNA表达分析未能顺利进行。（3）通过在30℃离体条件下四个不同剂量MC-LR暴露鲫鱼红细胞，AChE、Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活性均显著下降；LDH活性显著升高。溶血率从12h至48h过程中显著升高。同时还观察到鲫鱼红细胞出现肿胀，有些红细胞细胞膜溶解破损。（4）通过四个不同剂量MC-LR暴露HepG2细胞，观察到细胞形态和数量都发生了不同程度变化。利用MTT法检测到HepG2细胞增殖抑制率在低剂量呈现下降趋势，高剂量呈现上升趋势，并有明显的时间-效应和剂量-效应。此外获得了MC-LR暴露HepG2细胞24h、48h、72h的IC50分别为31.6215μg/mL、26.1980μg/mL、23.5116μg/mL。综合上述结果，本研究丰富了MC-LR致动物贫血效应的基础研究，为进一步阐述MC-LR的作用机制奠定了坚实的工作基础。