攻毒散结法对宫颈HR-HPV感染局部免疫微环境- - Foxp3表观遗传调控的影响

The cervical high-risk human papilloma virus (HR-HPV) infection is a requirement for cervical cancer. HPV virus whether would be removed or developed to cervical cancer, mainly depends on immune system, including the cervical local immune microenvironment. Foxp3 is one of important transcription factors to regulate T cells (Treg), and it is also maintaining its immunosuppressive function. The epigenetic regulation of Foxp3 regulates the maintain Foxp3 expression is critical. Currently, there is no effective western medicine to treat HR-HPV infection, but the traditional Chinese medicine has advantages. However, the mechanism is unknown that directly affects the clinical application of Chinese traditional medicine. In this study, we use the model of cervical cancer cell lines and mice to Foxp3 gene epigenetic regulation of histone H3K27 methylation modification as a starting point from tissue morphology, cellular and molecular level system of H3K27 methylation of histone modifications provide a scientific basis for changing the cervical plug in Qingdu local immune microenvironment interactions.We explore the molecular mechanism of the treatment and provide scientific basis for the clinical application.

宫颈高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染是宫颈癌发生的直接病因，HPV感染能否清除或是持续性感染进而发展为宫颈癌主要取决于机体的免疫力，其中宫颈局部免疫微环境是决定的关键因素。Foxp3作为调节性T细胞（Treg）重要的转录因子，对维持其免疫抑制功能起决定性作用，组蛋白甲基化修饰等表观遗传调控对控制Foxp3的表达起到关键作用。目前临床上对已感染HPV患者缺乏有效的治疗药物。我们以"攻毒散结"为法，研制出中药清毒栓在临床上取得了满意疗效，并对其作用机制进行了一些探索。本课题在原有研究的基础上，拟利用宫颈癌细胞株及小鼠宫颈癌模型，以Foxp3 基因表观遗传调控组蛋白H3K27 的甲基化修饰为切入点，从组织形态学、细胞、分子水平系统研究H3K27组蛋白甲基化修饰在清毒栓改变宫颈局部免疫微环境中的交互作用，力争进一步阐明清毒栓作用的分子机制，为中医药抗宫颈HPV感染的临床应用提供科学根据。

[目的]研究清毒栓对宫颈HR-HPV感染局部免疫微环境的分子调节机制。[方法]构建宫颈癌荷瘤小鼠模型，采用HE、TUNEL、IF、流式、ELISA、WB等方法，研究清毒栓灌胃处理对小鼠肿瘤体积及重量、体重、肿瘤组织增殖和凋亡、T淋巴细胞亚型以及肿瘤组织EZH2和Foxp3表达影响。在体外实验中，使用CCK-8、qRT-PCR、WB、CHIP以及构建Foxp3过表达质粒、使用EZH2抑制剂GSK126等，研究清毒栓含药血清对SiHa细胞活性、增殖与凋亡、Foxp3表达与其组蛋白甲基化水平、β-catenin通路、EZH2表达影响，同时也研究清毒栓含药血清对T淋巴细胞Foxp3表达、Foxp3甲基化水平以及EZH2表达影响。[结果]清毒栓灌胃处理可以有效抑制宫颈癌荷瘤小鼠体内肿瘤体积和瘤重，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，并增加Th1/Th2、Th17/Treg比例，抑制Treg细胞相关炎性因子分泌，同时也可抑制Foxp3表达并增加EZH2蛋白水平。体外实验结果发现：清毒栓含药血清可以显著抑制SiHa细胞活性，抑制细胞凋亡，改变细胞周期分布，降低Foxp3 mRNA和蛋白水平，促进Foxp3启动子区组蛋白甲基化水平，并可增加EZH2含量；而Foxp3过表达质粒和EZH2抑制剂GSK126可以逆转清毒栓含药血清诱导的Foxp3表达下调，增殖凋亡相关蛋白表达改变以及SiHa细胞活性下调。清毒栓含药血清同样可以降低jurkat T细胞Foxp3阳性细胞数，改变Foxp3启动子组蛋白甲基化水平以及EZH2含量；而EZH2抑制剂GSK126也可逆转清毒栓含药血清诱导的jurkat T细胞Foxp3表达下调。[结论]清毒栓可以通过增加EZH2含量促进Foxp3启动子组蛋白甲基化来改变Foxp3表达，从而抑制SiHa细胞中β-catenin通路导致细胞增殖下调细胞凋亡增加，并降低Treg细胞数目，最终抑制宫颈癌发生发展。