癌基因Pim-1在涎腺腺样囊性癌中对线粒体-细胞凋亡通路的抑制作用研究

As an oncogene, Pim-1 belongs to the Ser/Thr kinase family, and the overexpression of Pim-1 is involved in the apoptosis suppression. It has been reported that Pim-1 kinase phosphorylates RUNX3 and alters its subcellular localization.As a tumor supressor gene, RUNX3 can induce the mitochondrial-depended apoptosis. RUNX3 mislocalization is involved in the apoptosis. Our previous study showed that the RUNX3 mislocalization was related to the progression of the salivary gland adenoid cystic carcinoma (ACC). However, there is no report concerns about the Pim-1 and the ACC development. This study is supposed: 1. to investigate the alteration of the RUNX3 expression and cellular location as well as the apoptosis-related factors in the ACC cell lines after Pim-1 siRNA, to clarify whether the apoptosis is depended on the mitochondrial pathway; 2. to validate the gene function of Pim-1 on the ACC and hOMF cell line; 3. to detect the relationship between the Pim-1 and RUNX3, the Pim-1 and the apoptosis-related factors, the Pim-1 and the clinical pathologic and prognois parameters in the clinical ACC tissue. This study will demonstrate the anti-apoptotic function of Pim-1 in the ACC progression. It can insight into the ACC diagnosis, therapy and prognosis by targeting the Pim-1.

癌基因Pim-1在肿瘤中的重要作用与细胞凋亡密切相关,同时Pim-1还可导致RUNX3蛋白的异位表达。我们已证明RUNX3蛋白在细胞质中的异位表达和降解与涎腺腺样囊性癌（ACC）的发生、转移及预后密切相关，但Pim-1在ACC中的作用鲜有报道。本研究运用siRNA干扰、质粒转染、Westernblot、荧光发光、real-time PCR、流式细胞分析、免疫组化等技术，研究Pim-1在ACC的作用机制，包括：1) Pim-1在ACC中的基因功能，和Pim-1对RUNX3的调控以及对线粒体-细胞凋亡的抑制作用；2) 在临床ACC组织中研究Pim-1与RUNX3表达及细胞定位的关系，与线粒体-细胞凋亡中各关键分子的关系，以及与各临床参数的关系，同时进行预后分析。本研究将揭示Pim-1与ACC发生发展的关系，为评价Pim-1作为一个有效的肿瘤标志物用于ACC的诊断、治疗以及预后的可能性提供依据。

背景及研究内容：涎腺腺样囊性癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，且其发病机制尚未完全明确。Pim-1是重要的癌基因，它在很多恶性肿瘤中都有过表达现象。最近有研究表明，Pim-1蛋白可以磷酸化RUNX3蛋白且可导致RUNX3蛋白细胞质异位。还有研究表明FOXO3a、BAD 及 BCL-2参与了Pim-1介导的细胞凋亡。Pim-1激酶也是丝/苏氨酸激酶Pim家族的第一位成员，可磷酸化众多特异性底物以实现其功能，因此Pim-1有可能作为一个治疗靶点。SGI-1776是一个新型的针对Pim家族的抑制剂也是首个开展临床试验的抑制剂。在此研究中，我们拟通过体外Pim-1 siRNA转染和SGI-1776处理的方法研究Pim-1的基因功能。另外探讨ACC组织中Pim-1蛋白，RUNX3蛋白，细胞凋亡以及凋亡相关蛋白FOXO3a、BAD 及 BCL-2的临床意义。.结果：.1. 采用Pim-1 siRNA转染SACC-83及SACC-LM细胞，获得了良好的Pim-1敲除效果。同时采用Pim-1抑制剂SGI-1776处理SACC-83及SACC-LM细胞，可以有效抑制Pim-1蛋白的表达。并检测到了细胞增殖的减弱，细胞凋亡的发生，细胞周期的阻滞，线粒体膜电位的降低，Caspase-3的激活，RUNX3、Bcl-2、Bim、BAD及FoxO3α蛋白水平的改变；.2.构建了Pim-1慢病毒载体，转染至正常胃黏膜细胞GES-1获得了Pim-1过表达模型，并检测到转染细胞株细胞增殖以及克隆形成能力的增强；.3. 选取了ACC肿瘤组织和相应正常对照组织，real-time PCR和Westernblot检测结果显示Pim-1的mRNA和蛋白表达水平在ACC肿瘤组织中均高于相应正常对照组织；.4.选取ACC肿瘤组织，IHC法检测了Pim-1、RUNX3、Bcl-2、Bim、BAD及FoxO3α蛋白水平，同时用TUNEL法检测细胞凋亡水平。结果表明Pim-1表达和RUNX3、FoxO3α及细胞凋亡率显著相关，且与肿瘤大小、淋巴结转移、神经侵犯和远处转移均有显著相关性，对患者预后也有一定影响；.5. 肿瘤类型和细胞凋亡率是ACC患者的独立预后因子。.结论：本研究证明了Pim-1在腺样囊性癌中的癌基因功能，也提示Pim-1在腺样囊性癌中可能作为潜在的治疗和预后评估标志物。