基于荧光探针技术的药物协同抗耐药真菌作用机制研究

Infection caused by drug-resistant fungi has emerged as a severe disease endangering human health. The combination of berberine and other compounds with azoles can greatly improve the antifungal activity, although the related mechanism is still not clear. Recently, proteomic analysis reveals that hydrogen peroxide (H2O2) is likely crucial in the synergistic mechanism by inducing the damage to cellular structure and biomacromolecules. To clarify the exact H2O2-related synergism, a spiroboronate-containing fluorescent probe based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) is developed to monitor the concentration and location change of H2O2 in fungi with high accuracy. A biological model for the study of synergistic antifungi drugs will be developed on the basis of the fluorescent technique, which can be used in the study of mechanism. The proposed method is promising to provide important technique support for discover and design small molecules with synergistic antifungal activity.

深部耐药真菌感染已经成为危害人类健康的重要疾病。小檗碱、黄芩素等化合物协同氮唑类药物可以显著提高耐药真菌对药物的敏感性，但作用机制尚不明确。现有证据表明其协同机制可能与真菌胞内H2O2浓度的变化有关。为了直观的阐明协同机制中H2O2扮演的重要角色，本项目基于荧光共振能量转移机制，利用硼酯螺环开关诱导的信号调控，设计合成一种适用于真菌细胞成像的荧光探针，准确、快速、原位的分析监测协同抗耐药真菌过程中真菌细胞内H2O2浓度变化，验证阐明小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的“活性氧机制”。在此基础上，建立基于荧光探针技术的协同抗耐药真菌的生物学模型，应用于协同抗耐药真菌作用机制研究，为后续发现设计具有协同抗耐药真菌作用的小分子化合物提供重要的技术支持。

近年来深部真菌感染呈增长趋势，其系统性感染死亡率高，是引起癌症和艾滋病患者死亡的主要原因。氮唑类药物作为临床上治疗深部真菌感染的常用药物，疗效显著。但随着氮唑类药物的广泛使用，相应的耐药菌株日益增多，成为临床上治疗真菌感染失败的主要原因。面对日益严峻的耐药真菌感染，联合用药成为抗耐药真菌感染治疗的发展方向之一。本课题基于荧光共振能量转移机制，利用硼酯螺环开关诱导的信号调控，旨在研究出适用于真菌细胞成像的荧光探针，并应用于小檗碱协同氟康唑抗耐药真菌的“活性氧机制”，建立基于荧光探针技术的协同抗耐药真菌的生物学模型，为后续发现设计具有协同抗耐药真菌作用的小分子化合物提供重要的技术支持。通过本课题的研究，我们设计合成了含硼酯螺环结构的罗丹明荧光探针RB-H2O2，利用硼酯螺环开关实现信号调控，并在此基础上发展了基于FRET机理的适用于真菌细胞成像的荧光探针FRET-RB-H2O2，应用于真菌细胞内H2O2的识别成像，为真菌细胞生物成像研究奠定了基础；通过准确、快速、原位的监测真菌细胞中H2O2浓度变化，验证并阐明了小檗碱协同氟康唑抗耐药真菌的活性氧机制，为协同抗耐药真菌药物研究及药物作用机制研究奠定了基础。在此基础上，设计合成了30个新的协同抗真菌药物，并考察了其药理活性和作用机制。本课题还做了相关后续工作的研究，我们在罗丹明荧光探针的基础上设计了性质更为优越的磷基罗丹明荧光探针PRB-PA-H2O2。我们对磷基罗丹明荧光探针的光谱性质和识别性能进行了考察：包括它们的吸收和荧光发射光谱，探针的选择性、灵敏度以及抗干扰能力、识别机理、识别动力学、探针特殊的异构现象对性质的影响等。初步研究结果表明PRB-PA-H2O2有着较为优越的理化性质，这将为后续抗真菌药物研究及作用机制研究提供良好的技术支持。