AMPK通过磷酸化Foxp3调控Treg细胞功能的机制研究

Owing to the role of AMP-activated protein kinase (AMPK) in inflammatory diseases is unclear. Our preliminary study found that prkaa1-/- mice, but not WT mice, spontaneously developed massive inflammatory cell infiltration in multiple organs such as liver, lung, kidney, pancreas, salivary gland; and the mice also produced autoantibody. Importantly, prkaa1flox/flox Foxp3YFP-Cre mice developed similar phenotype (inflammatory cell infiltration in multiple organs), indicating that AMPK is required for sustaining of suppressive function of Treg cell and maintaining of immune homeostasis. To more precisely understand the intrinsic role of AMPKα1 in Treg cells, and the prkaa1flox/flox Foxp3YFP-Cre mice will be used as animal model in this study. This project is designed to investigate ⑴ whether AMPK plays a critical role in immune homeostasis through regulation of Treg function; ⑵ whether AMPK maintains Treg function by regulation of activity of Foxp3, a master transcription factor for Treg cell; ⑶ whether AMPK is capable of directly phosphorylating serine/ threonine in Foxp3, resulting in improvement of suppressive function of Treg cell. Combining with clinical study to confirm that AMPK phosphorylation of Foxp3 is involved in autoimmune diseases and GVHD, the completion of this study will help us understand novel underlying mechanism for regulation of immune homeostasis, and provide evidence for AMPK as a new target for treatment of autoimmune disorders and GVHD.

AMPK抑制炎症反应的机制并不清楚，我们发现AMPKα1基因缺失（小鼠prkaa1-/-）表现为自然发生多器官炎症病变，且有多种自身抗体产生；而且Treg细胞特异性AMPKα1基因缺失小鼠也有类似的自身免疫病表型。提示AMPK是Treg细胞发挥免疫抑制功能和维持免疫稳态所必需的，但是其机制尚未阐明。本研究用Treg细胞特异性AMPKα1基因缺失小鼠为模型，拟从动物整体水平研究AMPK是否通过调控Treg细胞功能来维持机体免疫稳态，从细胞和分子水平研究AMPK是否通过磷酸化转录因子Foxp3分子中特定位点丝/苏氨酸残基而增强它的生物学活性，从而维持Treg细胞的免疫抑制功能和稳定。再通过临床研究验证AMPK磷酸化Foxp3对自身免疫病和GVHD的免疫调控作用，旨在阐明AMPK维持机体免疫稳态的确切分子机理，为自身免疫病和GVHD治疗寻找新的靶点。

自身免疫病是一类常见的临床疾病，影响大约5-20%的人口，严重的自身免疫病可引起致残和死亡,已经是一个全球性健康问题。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg 细胞) 是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，它不仅在机体获得、维持自身免疫耐受以及自身免疫的防御过程中发挥着重要作用，而且在肿瘤、移植耐受以及病原体感染等免疫反应调节过程中也扮演重要角色。Treg细胞功能受到精确调控，能量代谢激酶AMPK是如何调控Treg细胞功能以及在自身免疫病（如自身免疫性肝病）发生的作用并不清楚。本项目构建了Treg细胞特性敲除prkaa1基因小鼠模型，通过体内、体外免疫学方法证明AMPK对Treg细胞功能的调控作用及相应的机制，再通过临床病例（自身免疫性肝病）加以验证。结果显示：Treg细胞特性敲除prkaa1基因小鼠可以自发产生多种自身抗体，转氨酶、胆红素升高，胆管周围、肝组织炎性细胞浸润，表现为典型的自身免疫性肝病特点；而且发生进程是随着年龄增长发病率增高、病变加重，与人类原发性胆汁性胆管炎（PBC）非常相似。因此，可以作为研究自身免疫性肝病（尤其是PBC）的良好动物模型。体内、外免疫功能抑制实验结果均显示：Treg细胞缺失prkaa1基因导致免疫抑制活性降低。机制研究发现：（1）Treg细胞特异性缺失prkaa1基因并不影响Foxp3 （Treg细胞发挥生物学功能的关键转录因子）的mRNA水平，但是影响Treg细胞中Foxp3 蛋白质水平；提示AMPK并不是调控FOXP3合成表达过程，而是影响FOXP3蛋白的降解过程。（2）在Treg细胞接受刺激、活化的过程中能量代谢激酶AMPK 也被激活，活化的AMPK可以发挥蛋白激酶活性可以磷酸化FOXP3。激活AMPK 可以使得FOXP3蛋白泛素化水平降低，发现抑制AMPK 活化可以使得FOXP3蛋白泛素化升高，促进FOXP3蛋白降解，使得FOXP3蛋白水平降低 ，活化AMPK可以提高FOXP3蛋白水平。PBC患者外周血中Treg细胞的比例较对照组明显减低，而且Treg细胞中AMPK磷酸化水平也明显较对照组低，表明AMPK通过磷酸化FOXP3调控Treg细胞功能在预防自身免疫性肝病发生过程中发挥重要作用。