PFOA诱导睾丸生殖细胞毒性损伤的机制及Nrf2的调控作用研究

Perfluorooctanoic acid (PFOA) exposure leads to male reproductive function damage. However, the specific mechanism of PFOA action is unclear. Nrf2 plays a key role in the regulation of stress response. Our previous study found that PFOA exposure inhibited Nrf2 expression and induced oxidative stress in the testicular tissue. Therefore, we speculate that Nrf2-dependent antioxidant defense system plays a role in regulating PFOA-induced testicular toxicity. In this study, the male reproductive toxicity of PFOA will be evaluated at organ, cell and molecular levels with emphasis on the relationships of PFOA-induced testicular toxicity to germ cell apoptosis and autophagy. Furthermore, the activation and inhibition of Nrf2 signaling pathway were induced to investigate the protective effect of Nrf2 on PFOA-caused testicular damage. Moreover, the expression and activity of Nrf2 and its targeted antioxidant enzyme genes were determined and the expression of apoptosis-related genes and autophagy-related genes was detected to analyze the effects of Nrf2 system on germ cell oxidative stress, apoptosis and autophagy. These studies will reveal the molecular mechanisms of PFOA action and regulatory effects of Nrf2 signaling pathway on PFOA-induced testicular toxicity, and provide a new target for the prevention and treatment of abnormal spermatogenesis and male infertility caused by perfluorinated compounds.

全氟辛酸(PFOA)可导致男性生殖功能损伤，其具体机制尚不明确。Nrf2在调节应激反应中具有关键作用。我们前期实验发现PFOA抑制了Nrf2的表达，并导致睾丸组织氧化应激。据此，我们推测“以Nrf2为核心的抗氧化防御系统对PFOA的睾丸毒性具有调控作用”。本项目拟在器官、细胞及分子水平探讨PFOA对雄性小鼠生殖系统的毒性损伤作用机制，重点关注PFOA生殖毒性与生殖细胞凋亡和自噬的相关性，并通过Nrf2信号通路的激活和抑制观察Nrf2系统对PFOA诱导的睾丸生殖细胞损伤的保护作用。从基因转录、蛋白质表达和活性水平测定Nrf2及其下游抗氧化酶基因的表达，并通过检测凋亡和自噬相关基因的表达阐明Nrf2系统对生殖细胞氧化应激、凋亡和自噬的保护作用，从而揭示PFOA引起睾丸生殖细胞损伤的分子机制，以及Nrf2通路对PFOA生殖毒性的调控作用。为防治全氟化合物引起的精子发生异常和男性不育提供新的靶点。

本项目在整体和离体精原细胞培养条件下研究了全氟辛酸（PFOA）对小鼠睾丸生殖细胞毒性损伤的作用，重点探讨了Nrf2为核心的抗氧化防御体系对PFOA引起的生殖细胞损伤的保护作用及其机制。结果表明，PFOA能够增加小鼠睾丸组织和体外培养的精原细胞活性氧(ROS)的生成，降低精原细胞细胞活性，增加细胞膜脂质过氧化产物MDA的产生，降低细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。同时，PFOA显著下调了Nrf2及其下游靶基因HO-1、SOD和CAT的表达，并增加了促凋亡蛋白Bax和P53的表达，并降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外，PFOA降低了精原细胞线粒体膜电位和ATP的生成。TUNEL染色结果也表明，PFOA诱导了精原细胞凋亡。透射电镜细胞超微结构观察表明，PFOA显著增加了精原细胞内自噬泡的生成。而且PFOA处理显著上调了自噬相关蛋白LC3B-II/LC3B-I表达的比例。以上结果说明PFOA能够通过抑制Nrf2表达，诱导氧化应激、凋亡和自噬，从而导致小鼠睾丸生殖细胞毒性损伤。此外，我们观察了Nrf2信号系统对PFOA引起的生殖细胞损伤的调控作用。结果表明，Nrf2-ARE信号通路的天然激活剂Que显著缓解了PFOA诱导的小鼠睾丸生精细胞氧化损伤。和PFOA处理组相比，Que显著降低了MDA的生成，提高了SOD和CAT的活性，并增加了Nrf2及其下游解毒酶基因HO-1、SOD和CAT的表达。而且，Que显著抑制了PFOA诱导的生殖细胞凋亡。和对照组相比，Que显著降低了生殖细胞Bax和P53表达，并增加了Bcl-2表达。以上结果说明Nrf2-ARE信号通路的激活能够促进Nrf2下游抗氧化酶的表达，降低细胞内ROS产生，抑制睾丸生殖细胞氧化应激和凋亡，从而对PFOA引起的生殖系统毒性损伤起保护作用。我们的研究结果可为预防和治疗全氟化合物导致的精子发生异常供理论基础。