新型无氧同型发酵纤维乙醇工程菌的构建

本项目的研究旨在构建一种全新的纤维乙醇工程菌。以具有天然利用五碳糖和六碳糖能力的野生株大肠杆菌W为出发菌株，通过染色体基因敲除及启动子替换技术构建一条天然同型乙醇发酵途径（丙酮酸- - >乙酰辅酶A- - >乙醛- - >乙醇）。在此基础上,通过筛选Crp突变基因、敲除葡萄糖PTS运输基因ptsG、取代五碳糖运输和代谢基因的启动子的方法进一步消除大肠杆菌分解代谢抑制作用,使新构建的菌株能同步利用五碳糖和六碳糖进行同型乙醇发酵。该研究项目可解决同型发酵生产还原型化合物额外所需还原势（NADH）的技术关键，从而为我国今后利用纤维原料生产乙醇或其它的高还原势化合物提供理论和技术支撑。

纤维乙醇工程菌的构建是利用木质纤维素原料生产燃料乙醇的一个必须解决的关键问题。本项目针对当前纤维乙醇工程菌待解决的问题进行了如下研究：首先，通过基因重组技术已成功地将乳酸脱氢酶（ldhA），丙酮酸－甲酸裂解酶（pflB），延胡索酸还原酶（frdABCD）及乙酸激酶（ackA）等基因从E. coli W 菌株的染色体上敲除掉，把与乙醇产生途径有关的竞争性有机酸代谢途径关闭掉，从而使糖酵解代谢碳源（丙酮酸）及还原势（NADH）都流向乙醇。其次，通过转录融合技术，已成功将丙酮酸—甲酸裂解酶基因的两个无氧表达启动子pflBP6-7与丙酮酸脱氢酶操纵子转录融合，使丙酮酸脱氢酶在无氧条件下可以高效表达。通过改造，将还原势NADH 的产出提高了一倍，满足了乙醇发酵对还原势的要求，在成功构建了一株无氧同型乙醇发酵途径的同时，也解决了同型发酵生产还原型化合物额外所需还原势（NADH）的技术关键，从而为我国今后利用纤维原料生产乙醇或其它的高还原势化合物提供了理论和技术支撑。再次，为了达到大肠杆菌同时利用五碳糖和六碳糖的目的，成功敲除了cra基因和RNase G基因的HSRII片段，分别获得三株工程菌RM03 (△cra)、RM10 (△rng HSRII) 和RM07 (△cra，△rng HSRII)。发现工程菌RM10对木糖和阿拉伯糖的利用有极为显著的提高，产物乙醇浓度也增加了近一倍，而对葡萄糖利用效率则无明显改变。RT-qPCR研究发现adhE、eno及aceE三个基因mRNA表达量在RM10 （rng-）菌株中比其在对照菌株SZ470（rng+）菌株中分别高出409，164和64倍，揭示了通过核酸酶的基因敲除，有助于产物合成及碳代谢中心途径相关基因表达水平的提高。本研究不仅建立和丰富了大肠杆菌碳中心代谢途径五碳糖中心代谢调控新机理，而且而且为构建高效纤维乙醇工程菌提供理论依据和新的研究思路。最后，敲除葡萄糖转运基因 ptsG，以构建不受葡萄糖抑制效应影响的菌株 SZ470P。SZ470P 在 5％混合糖 (2.5％木糖和 2.5％葡萄糖) 培养基中能同时利用葡萄糖和木糖进行发酵，葡萄糖消耗量是 13 g/L，为对照菌株 SZ470 的一半；木糖消耗量是 20 g/L，是 SZ470 的 3.8 倍。结果表明ptsG的敲除策略，进一步提高了大肠杆菌对五碳糖和六碳糖的同步利用的能力