应用CRISPR/Cas9慢病毒文库研究新的猪异种抗原及其介导移植排斥的作用机制

Organ transplantation represents a unique method to treat people with end-stage organ failure. However, a persistent shortage of organs and inexhaustible waiting lists remain the biggest obstacle. To address this problem, attempts have been made to increase the organ supplies available for transplantation from bioengineering animals more recently. Swine are currently considered the most likely xenotransplant donors. However, the much more intense rejection response in xenotransplantation remains a core problem. Thus, addressing new xenoantigens is another significant step towards controlling immune rejection responses to xenotransplants. Our previous work includes the establishment of a functional method to select human IgG/IgM tolerant PAEC by human serum-mediated cytolysis, the research of T cell immune co-stimulators in xenotransplantation, the establishment of a CRISPR/Cas9 library targeting 927 swine genes. To be continued, this project aims to discover new non-Gal xenoantigens through CRISPR/Cas9 lentiviral library, xenoantigens’ gene expression specificity and the molecular mechanisms involved in immune rejection. The accomplishment of this project is expected to explore immune rejection related xenoantigens, demonstrate their molecular mechanisms in immune rejection and provide theoretical basis for the production of bioengineering pigs with compatible organs for xenotransplantation.

器官移植是治疗晚期器官衰竭的有效方法，但供体器官的匮乏限制了器官移植的临床应用。猪与人在基因组上高度同源且器官功能相近，被认为是最合适的异种器官供体。由于人体对异种器官具有强烈的排斥性，因而研究排斥相关的异种抗原，并对其进行基因工程改造是降低排斥反应的有效手段，但哪些异种抗原与排斥相关尚不明确。本团队已建立研究异种抗原的实验平台，发现T细胞共刺激分子IDO1参与异种器官移植排斥，并构建了针对927个猪基因的CRISPR/Cas9慢病毒文库。在此基础上，本项目拟：（1）应用该文库研究异种移植免疫排斥的关键异种抗原，（2）应用免疫荧光等方法明确异种抗原基因的表达及亚细胞定位，（3）建立敲除或过表达异种抗原的猪内皮细胞，应用细胞溶破和肾囊膜移植实验研究异种抗原介导免疫排斥的分子机制。本项目的实施将为异种器官移植基因工程猪的构建提供理论基础，有助于解决异种器官移植免疫排斥的临床问题。

异种器官移植被认为是解决移植用供体器官匮乏的潜在有效手段。猪与人在基因组上高度同源且器官功能相近，被认为是最合适的异种器官供体。由于人体对异种器官具有强烈的免疫排斥性，因而研究排斥相关的异种抗原，并对其进行基因工程改造有助于降低异种器官移植的免疫排斥反应。.本研究通过分析猪相对于人特异表达的膜蛋白/糖蛋白基因，并针对这些基因设计CRISPR/Cas9 慢病毒文库，筛选在猪-非人灵长类异种器官移植体系下的异种抗原基因。通过本研究，我们发现：1）应用人血清介导的猪血管内皮细胞（PAEC）杀伤实验系统和CRISPR/Cas9 慢病毒文库，筛选出了一系列特异性猪异种抗原基因。2）通过系统分析猪与人的蛋白序列差异性，并预示这些分子差异与猪-非人灵长类异种器官移植后异常凝血反应的相关性。3）在人血清介导的猪血管内皮细胞杀伤实验中，我们发现COX-2在人血清介导的猪血管内皮细胞死亡中发挥重要的调控作用。本研究的实验结果，为应用于降低异种器官移植的免疫排斥反应打下坚实的理论基础；此外，以COX-2为作用靶点，可能对保持移植器官的血管内皮细胞生物学活性具有重要的作用。