鸡球虫共同抗原的确认及免疫原性分析

Avan coccidiosis is one of the diseases that result significant economic losses to the poultry industry. The application of anti-coccidial drugs has been limited because of the generation of drug-resistant strains of Eimeria and the problem of drug residue. With the shortcoming of resulting prevalence easily, high cost and difficult to save, the application of traditional live oocyst vaccine also has been limited. As neotype vaccine, DNA or subunit vaccine show attractive prospect in the control of livestock and poultry disease for its unique advantage. Effective vaccine shall be resistant to the mixed infection of Eimeria which is very common clinically, so the excavation of common antigen of coccidian appears to be very urgent and necessary. To explore common antigen of coccidian for the development of coccidian vaccine, in this research, the sporozoite protein of E. tenella, E. necatrix, E. acervulina and E. maxima will be the separated by two-dimensional electrophoresis technique and the screening of immunogenic antigen protein will be performed using the serum of chicken infected with coccidian. After comparison of sporozoite proteins spots of the four Eimeria species, the common protein spots will be analyzed by mass spectrometry, and amino acid sequence of the common antigen will be analysised and the common antigen gene will be cloned to construct eukaryotic and prokaryotic expression plasmid. The common antigen recombinant protein and the eukaryotic expression plasmid will be used to immune chickens, respectively, to determine the immunogenicity of the common antigen from the level of humoral immunity, cellular immunity and immune protection. Eventually, Eukaryotic plasmid or recombinant protein with good immunogenicity will be select as the candidate DNA vaccine or subunit vaccine against coccidiosis. The results of our research will provide a reference to resolve the mixed infection of chicken coccidian.

鸡球虫病是严重危害养禽业的疾病之一。药物防治受到耐药性虫株和药物残留等问题的限制，传统活苗存在着易散毒、成本居高、难保存等缺点，其使用也受到了限制。作为新型疫苗，DNA疫苗和亚单位疫苗以其独特的优势显示其在畜禽疫病控制中的诱人前景。有效的疫苗须能抵抗临床上常见的混合感染，因此，多种球虫共同抗原的发掘显得十分迫切和必要。为发掘鸡球虫共同抗原，本研究通过二维电泳技术分离4种球虫子孢子阶段蛋白，分别用感染球虫鸡血清筛选免疫原性抗原蛋白，比较4种球虫子孢子蛋白点，选择相同的蛋白点进行质谱分析，确定共同抗原，将共同抗原基因进行克隆并构建真核和原核表达质粒，用共同抗原重组蛋白和真核表达质粒免疫鸡，分别从体液免疫水平、细胞免疫水平和免疫保护性研究共同抗原的免疫原性，确定共同抗原的免疫原性，选出具有良好免疫原性的真核质粒或重组蛋白作为鸡球虫病候选DNA疫苗或亚单位疫苗，为解决鸡球虫混合感染提供参考。

鸡球虫在临床上往往为混合感染，鸡球虫病每年给全球养禽业带来超过30亿美元的经济损失。目前，主要防控措施是使用抗球虫药和传统活卵囊疫苗，然而药物存在着耐药性、药物残留等缺点，活疫苗又存在成本居高和易散毒等问题，其使用受到了限制。新型疫苗DNA疫苗和亚单位疫苗研究以其独特的优势显示其在畜禽疫病控制中的诱人前景。有效的疫苗须能抵抗临床上常见的混合感染，因此，多种球虫共同抗原的发掘显得十分迫切和必要。为发掘鸡球虫共同抗原，本研究通过二维电泳技术分离3种球虫孢子化卵囊蛋白，分别用感染球虫鸡血清筛选免疫原性抗原蛋白，对3种球虫的蛋白点进行质谱分析，进行在线比对，将氨基酸序列同源性在3个种之间在90%以上的抗原确定为共同抗原，将共同抗原基因进行克隆并构建真核表达质粒pVAX1.0，并免疫鸡，分别从细胞免疫水平和免疫保护性研究共同抗原的免疫原性。结果显示E. tenella、E. acervulina和E. maxima分别有50个、64个和57个蛋白点能被鸡抗球虫血清识别，表明这些蛋白具有良好的抗原性。其中延长因子2在3个种之间蛋白序列同源性为99%，遍在蛋白缀合酶结构域在3个种之间的蛋白序列分别为97%，99%和100%，14-3-3蛋白在3个种之间的蛋白序列同源性分别为96.5%，96.7%和94.1%，延长因子1-α在3个种之间的蛋白序列相似性分别为在95%，96%和98%，3-磷酸甘油醛脱氢酶在3个种之间的蛋白序列同源性分别为96%，91%和93 %。对遍在蛋白缀合酶结构域，14-3-3蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶的免疫原性和免疫保护性进行了研究。结果表明，上述3种共同抗原所构建的真核表达质粒能够显著促进CD4+和CD8+淋巴细胞的增殖，有效促进IFN-γ、IL-2等细胞因子的分泌，说明上述共同抗原能有效地诱导鸡体的细胞免疫反应。动物免疫保护实验结果显示，14-3-3蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶免疫组的抗球虫指数都在160之上，说明上述2种共同抗原能够有效地抵抗3个种的单独感染和混合感染。而遍在蛋白缀合酶结构组的免疫保护效果不明显。总之，本研究筛选到了3种球虫的3个共同抗原，都具有良好的免疫原性，其中2种共同抗原种能够抵抗3种球虫的混合感染。本研究为多价新型疫苗的研制提供了有效的候选抗原，为解决鸡球虫混合感染提供参考。