基于造血活性小肽的阿胶炮制原理研究

Based on previous research and literature survey, the project speculated that the macromolecule protein in processed Ejiao (Donkey-hide gelatin) decomposed regularly. The effective enriching blood substances of Ejiao and processed product after absorbed were small peptides, and they might be related to OGP. In order to verify the hypothesis, the peptides were isolated and purified by enzyme hydrolysis in vitro or detection after absorbtion in vivo method. Then the obtained samples’ primary sequences were determined by mass spectrometry or amino acid sequence automatic analyzer method. Meanwhile, the sufficient samples were obtained by preparative HPLC or Fmoc solid-phase synthesis method. Finally, BFU-E was used as the indicator to screen the samples, to select the small peptide sequences with obvious hematopoietic function of bone marrow cells. So as to learn the enriching blood material basis of Ejiao and processed product, then to explain the decomposing mechanism of Ejiao before and after processing from the small peptides level.

本项目依据前期研究和文献调研推测：阿胶炮制后大分子蛋白有规律性的裂解，阿胶及炮制品被肠吸收，并起补血作用的有效物质为分子量较低的小肽，且这些小肽还可能与OGP有关。为验证该假说，本项目首先采用体外酶解法或体内吸收后检测法对小肽进行分离纯化；然后对得到的样品采用质谱法或氨基酸序列自动分析仪法进行一级序列测定，同时采用制备型HPLC法或Fmoc固相合成法获取足量小肽样品；最后以BFU-E为指标对各样品进行活性筛选，从中选出具有明显提升骨髓细胞造血功能的小肽序列。从而获知阿胶及炮制品的补血作用物质基础，并从小肽层面阐释阿胶炮制前后肽裂解的规律。

背景：基于全肽谱对阿胶炮制品及阿胶不同组分进行研究，以期获知阿胶炮制机理及阿胶中具有造血活性的小肽序列。.研究内容：通过HPLC指纹图谱相似度分析，以色谱峰RSD（tR）为指标，验证阿胶经酶解后产生固定的酶解物成分；以阿胶及炮制品的酶解-超滤物为研究对象，通过Orbitrap-MS结果对样品进行数据解析，结合韦恩图和热图聚类分析，推断出可能具有造血活性的肽；采用Fmoc固相合成法对其进行合成，并进行纯度、TFA残留、净肽含量、内毒素等检测；以BFU-E为指标对阿胶及炮制品的酶解-超滤物和13种合成肽进行活性检测。为了进一步探知阿胶生品酶解物中的有效肽，采用“酶解-超滤-离子交换色谱-凝胶色谱”联用的方法分离得到阿胶的25种组分冻干粉，并采用与炮制原理研究相同的方法进行研究。.重要结果及数据：除木瓜蛋白酶外，阿胶经酶解后的小肽成分相对固定。从阿胶及炮制品酶解物中共检测出171种肽，其中127种源于胶原蛋白。蛤粉炒后26种肽产生， 21种肽消失，蒲黄炒后16种肽产生，52种肽消失，多数肽序列不变，但含量有所改变。以其中13个肽为对象进行了Fmoc合成，经检测均可用于细胞培养。阿胶经炮制后BFU-E显著增高，ejp33（GVVGLPGQR）、ejp10（GPAGPIGPV）具有相对较高的造血活性。通过酶解-超滤-色谱法获得25个组分，经BFU-E初筛发现3个有效部位，并从中检测出71种肽。推测并合成出具有潜在造血活性价值的肽共18种，其中ejcp30（SVGPVGPAGPIG）及ejcp5（GPIGPVGAR）具有相对较高的造血活性。.科学意义：阿胶炮制后，造血活性显著升高，推测胶原蛋白裂解并经消化产生ejp33强活性肽、ejp131弱活性肽以达到增效作用，且其促造血效果是以ejp10、ejp6、ejp77为主的数种肽的协同作用。在阿胶的酶解物组分研究中，发现ejcp30及ejcp5是阿胶中重要的有效造血活性肽。而ejcp103和ejcp107可能是起造血辅助作用的主要非胶原蛋白肽、ejp23、ejp126可能是起造血辅助作用的主要胶原蛋白肽。此外，还发现了ejcp107、ejp23、ejp6等肽能够促进巨噬细胞的分化。