Krüppel样因子4对SQSTM1／p62的调控在糖尿病肾小球血管内皮细胞损伤中的作用

The decreased autophagy level of glomerular endothelial cells (GEnCs) plays a key role in the pathogenesis of diabetic nephropathy, while the upstream mechanism is not fully elucidated.Related studies, along with our previous, have demonstrated that diabetes-induced GEnCs injury is associated with decrease of KLF4 expression. Moreover, KLF4 could bind to the SQSTM1 / p62 promoter to affect autophagy level by regulating the expression of SQSTM1 / p62. However, whether the downregulated expression of KLF4 is the upstream mechanism of the decreased autophagy level of GEnCs in DKD is not yet clear. The present study plans to elucidate the following questions using both in vitro and in vivo experiments in GEnCs: (1) Whether KLF4 could participate in the impaired cellular autophagy through regulating the expression of SQSTM1 / p62; (2) Whether upregulating KLF4 could attenuate the GEnCs dysfunction by increasing autophagy level. This project might be of great significance in understanding the mechanism of diabetic GEnCs injury and exploring novel interventions for diabetic kidney disease.

肾小球血管内皮细胞自噬能力下降是糖尿病肾病发生发展的关键环节，但上游机制尚未完全阐明。国内外相关研究及课题组前期研究发现，糖尿病环境诱导的肾小球血管内皮细胞损伤伴有KLF4表达降低；KLF4可与SQSTM1/p62启动子结合，通过调控SQSTM1/p62的表达进而影响细胞自噬。那么糖尿病状态下KLF4表达降低是否是DKD状态下肾小球血管内皮自噬能力下降的上游事件目前尚不清楚。本项目以肾小球血管内皮细胞为研究对象，拟采用体内试验和体外试验相结合的方法探讨以下问题：(1)KLF4是否通过调控SQSTM1/p62参与DKD肾小球血管内皮细胞的自噬能力下降；(2)上调KLF4能否通过改善DKD肾小球血管内皮细胞的自噬以缓解肾小球血管内皮损伤。完成本项目对于深入理解糖尿病肾小球血管内皮细胞损伤的机制以及寻找有效的干预措施均具有重要意义。

目的:糖尿病肾病(DKD)是世界范围内终末期肾脏疾病的主要原因。DKD是糖尿病的严重并发症，根据微量白蛋白尿进行诊断。蛋白质(如白蛋白)通过肾小球毛细血管的渗漏可导致尿中白蛋白的存在，这是肾脏疾病的一个标志，可以反映其他微血管床血管完整性的丧失。DKD也是糖尿病严重的微血管并发症。此外，与高血糖相关的微血管损伤导致毛细血管损伤、炎症、细胞外基质沉积、最终纤维化和肾单位丢失的恶性循环。高糖诱导的血管内皮细胞损伤是糖尿病血管并发症的关键起病因素。因此，研究其机制及相应的保护措施对糖尿病血管并发症的治疗具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究试图探讨DKD血管内皮细胞损伤的自噬机制。.方法:分别在SD大鼠和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上建立DKD和血管内皮细胞损伤模型。通过瞬时转染质粒构建过表达KLF4的HUVECs。尿蛋白、血尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)和肌酐(Scr)水平的生化测定。采用碘酸-希夫(PAS)染色观察肾脏病理。采用CCK8、TUNEL和ICC分析HUVECs的生长和凋亡情况。免疫荧光法观察LC3的表达。采用流式细胞仪检测ROS水平。ELISA法检测MCP-1、KLF4、TNF-α水平。采用qRT-PCR检测KLF4、p62、LC3基因的表达。western blot检测S6K、p-S6K、Beclin1、ATG5、LC3、p62、Caspase-3、mTOR和p-mTOR的表达。.结果:DKD大鼠PAS阳性物质(多糖、糖原)和S6K蛋白表达增加，LC3蛋白表达降低。DKD大鼠尿蛋白、BUN、Scr水平升高，KLF4水平降低。高糖诱导HUVECs增殖下降，凋亡率升高。hg诱导HUVECs中ROS、TNF-α、MCP-1、p62表达升高，SOD、KLF4、Beclin1、ATG5、LC3表达降低。与e- nc组相比，KLF4过表达可显著增加hg诱导HUVECs中Beclin1、ATG5和LC3蛋白的表达，降低p62蛋白的表达。KLF4过表达可抑制hg诱导HUVECs中Caspase-3、p-mTOR和p-S6K的表达。