超声波辅助强化酶水解制备低聚木糖的机理研究

xylooligosaccharides(XOs), as an important functional oligosaccharides, is prepared mainly by hydrolyzing xylan with xylanase. However, traditional treatments have some shortcomings such as long reaction time, low production, etc. Through some experiments, it has been found that the production could be greatly improved by integration of enzymatic hydrolysis and ultrasonic wave while the influence mechanism remains unknown. This project will be carried out from the following aspects: 1) identifying the key factors influencing hydrolytic result by comparing the enzymatic hydrolysis with and without ultrasonic treatment; 2) checking the changes of ultrasonic medium, enzymatic substrate and xylanase respectively under ultrasonic treatment, monitoring the changes of relative parameters by using analytic tool such as ECD，XRD、TGA、SEM and HPLC, etc., thus finally deciding the mechanism of the whole reaction system under ultrasonic treatment; 3) constructing a model for the preparation of XOs by xylanase coupling with ultrasonic wave; identifying the type of ultrasonic effects by contrasting important parameters. To sum up, the purpose of this project is to reveal the mechanism of hydrolyzing by xylanase coupling with ultrasonic wave, to shed light on the key mechanism of ultrasonic wave in affecting enzymatic hydrolysis, so as to improve the preparation efficiency of XOs in industry, reduce the production cost markedly and finally bring immense economic and social benefits.

低聚木糖作为重要的功能性寡糖，主要通过木聚糖酶水解天然纤维质材料中木聚糖获得，但传统制备方法存在着反应时间长、产率低等缺点。笔者通过前期试验发现利用超声波对酶解反应进行耦合可以显著提高产物（低聚木糖）得率，但其中的影响机制尚不清楚。本项目拟从以下方面进行：1）对比有无超声波作用时酶解反应情况，确定影响水解效果的关键因素；2）分别考察超声介质、酶解底物及木聚糖酶在超声波作用前后变化，运用ECD，XRD、TGA、SEM及HPLC等分析手段测定相关参数，最终确定超声波对整体反应体系的作用途径；3）模拟并构建超声波作用下木聚糖酶水解制备低聚木糖模型；通过关键参数对比，推断超声效应的作用类型。通过本项目的研究，可望在理论上揭示超声波耦合木聚糖酶促进水解效率的机制，阐明超声波影响酶解反应体系的关键途径；在应用上可以提高实际生产中低聚木糖的制备效率，有效降低其生产成本，可望带来巨大的经济和社会效益。

低聚木糖一般通过木聚糖酶水解天然纤维质材料中木聚糖制备，因此反应过程无法进行有目的干预。而超声波耦合酶解可以有效地促进多种酶促反应，提高产物生成效率。但国内外尚未有关于超声场耦合木聚糖酶水解制备低聚木糖机理层面的研究。本研究通过高通量筛选获得一株可高产酸性木聚糖酶菌株XAF01，通过形态学、生理生化、分子生物学鉴定该菌株为微紫青霉（Penicillium janthinellum）。该菌株XAF01在发酵过程中可产生3种不同分子量的木聚糖酶（XynA、XynB、XynC）。实验采用硫酸铵盐析、SP-Sepharose Fast Flow及Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析对微紫青霉XAF01所产的木聚糖酶XynB进行分离纯化并得到电泳纯XynB。纯化过程酶活回收率为2.09%，纯化倍数为1.70，XynB分子量为24.1 kDa。同时确定木聚糖酶XynB最适pH为3.8，在pH3.2~4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中具有良好的pH稳定性，50℃处理30min，相对酶活力仍在84%以上。该酶最适反应温度为50℃。该酶对榉木木聚糖的Km值为23.12±7.16mg/mL，Vmax为189.2±35.4 μmoL/min/mg。研究发现超声预处理酶溶液能够提高目标产物的得率，具体为经强度0.40W/cm2的超声预处理10min后XynB较未做处理酶解效率提高61.80%。圆二色谱法结果表明，超声处理使XynB的β-折叠含量减少，无规则卷曲含量增加，而α-螺旋的含量变化并无规律性。表明超声处理改变了包括氢键在内的维持木聚糖酶XynB蛋白二级结构的作用力，从而使二级结构的含量发生了变化。超声改变了XynB的最适pH，不改变其最适温度。超声使木聚糖酶XynB的Km减小，Vmax增大，增强了其催化底物的能力。结果显示超声预处理底物使目标产物得率增加，经超声预处理10min的底物酶解后较未做处理的底物还原糖得率提高64.87%。扫描电镜观察结果表明，超声使水不溶性木聚糖颗粒出现裂缝，甚至破裂成更小的颗粒。激光粒度分析仪结果表明，不同超声时间处理后，底物的粒径分布向小的粒径方向迁移。以上均为超声影响酶促反应的主要因素。通过该项目实施，较全面的探究了以木聚糖酶解制备低聚木糖为模型超声处理在酶催化体系中的影响机制，结果具有一定的创新性。