大豆查尔酮还原酶（CHR）在大豆苷元合成中的作用机理研究

大豆苷元是异黄酮的主要组分之一，是重要的生理活性物质，也对大豆抗病有重要的影响。对大豆苷元合成和调控途径进行研究具有重要的理论和应用价值。目前对大豆苷元合成途径中查尔酮还原酶（CHR）的类型、功能、作用机理等研究比较薄弱，不能实现对苷元合成代谢的有效调控。本研究克隆不同类型CHR基因，构建乳酸菌表达载体，转化获得乳酸工程菌，按比例混合发酵，复合表达大豆CHR基因和查尔酮合成酶CHS基因，通过对乳酸菌中表达产物的检测，研究CHS和CHR基因联合作用机理，鉴定不同CHR基因的功能和效率，探索大豆苷元合成途径调节机制；同时构建植物表达载体和RNAi植物表达载体，分别转化大豆子叶节，通过增量表达和RNAi诱导基因沉默，分析CHR基因对大豆苷元合成的影响，鉴定不同CHR基因的功能和效率，探明在大豆苷元合成途径中CHR作用机制，为利用基因工程技术调控大豆苷元合成代谢，选育抗疫霉根腐病种质奠定理论基础。

大豆苷元（Daidzein）是大豆异黄酮的主要组分之一，与染料木素（Genistein）和黄豆黄素（Glycitein）组成了含量比例超过98%以上的大豆异黄酮类化合物。与染料木素相比，大豆苷元在生理功能、合成途径及表达应用等方面的研究均落后于前者。这主要因为针对大豆苷元合成途径中的所必需的关键酶——查尔酮还原酶（CHR）研究基础比较薄弱。4，2'，4' -三羟基查尔酮（异甘草素）是大豆异黄酮生物合成所必需的前体物质，只有在CHR存在的情况下，与大豆查尔酮合成酶（CHS）联合作用共同催化形成异甘草素。所以CHR是大豆苷元合成途径中所必须的关键酶。针对大豆CHR基因的探索研究可以揭示异黄酮类化合物功能与结构的多样性及其生物合成途径的各种基因复杂的调控关系，为研究植物次生代谢途径中的基因调控表达提供了一个理想的研究模型。本研究旨在通过克隆大豆来源的CHR新基因，分别构建植物表达载体和乳酸乳球菌表达载体，再分别转化到烟草和乳酸乳球菌中进行表达，鉴定目的基因的功能，并且探讨大豆CHR基因在大豆防御疫霉根腐病方面的关系，根据转化获得的重组乳酸乳球菌，建立发酵生产大豆苷元的工艺体系，为利用基因工程技术调控大豆苷元的合成代谢奠定理论基础。取得的主要结果有：在大豆EST文库中扫描得到了三个查尔酮还原酶基因相关标签片段并利用RACE技术分别获得了具有完整序列的大豆查尔酮还原酶基因CHR2（Genbank：KF758395）、CHR3（Genbank code：KF927169）和CHR4（Genbank：KF938604）；分析了基因序列中保守区域，比较了不同的CHR基因的进化关系，发现三种新基因与已知基因的保守结构域种类相同；将目的基因分别转化到模式植物烟草中，再通过Real-time PCR技术和HPLC技术验证了新基因表达产物的生物活性功能；通过Real-time PCR技术分析了在大豆疫霉根腐病菌刺激诱导下，不同组织不同时间基因表达量的变化。通过高效液相色谱技术分析CHR所影响的异甘草素的含量的变化量。同时与大豆已知的查尔酮还原酶基因相比较，描绘了不同CHR基因在表达调控方面的差异；本研究根据大豆中所克隆的CHR基因，构建乳酸菌表达载体，转化获得乳酸工程菌，按比例混合发酵，复合表达大豆CHR基因和查尔酮合成酶CHS基因，通过对乳酸菌中表达产物的检测，验证CHR基因的功能和效果