微生物对毒死蜱降解机理研究

利用降解菌产生的降解酶降解农药具有高效、无污染等特点，是修复农药污染环境和去除食品中农药残留的重要手段之一。本课题在前期已筛选出可高效降解毒死蜱的降解菌株并已克隆其降解基因的基础上,利用定点突变技术构建重要候选基因的突变株，通过研究这些基因缺失后对毒死蜱降解率的影响确定2-4个后备蛋白基因；并通过生化功能研究，结合体外实验，确定这些蛋白的作用机理，从而提高我们对微生物对毒死蜱降解机理的认识；体外表达、纯化这些蛋白，对降解酶进行纯化后，进而研究降解酶结构和降解性能之间的关系、降解酶对底物偏好性识别降解的结构基础，并利用X射线吸收光谱研究降解酶发挥作用后，金属位点局部结构的微弱变化，为揭示农药降解酶空间结构变化与降解性能关系及农药降解作用机制奠定理论基础。

有机磷农药的大量使用在消灭害虫确保农业生产的同时，环境中残留的农药给人类健康带来许多危害。快速、有效的清除环境中的农药残留已成为目前研究的热点。从污染环境中分离筛选高效降解菌，利用降解菌产生的降解酶降解农药具有高效、无污染等特点，是修复农药污染环境和去除食品中农药残留的重要手段之一。.本课题以分离获得的高效毒死蜱降解菌株施氏假单胞菌YC-YH1(Pseudomonas stutzeri YC-YH1)为研究材料，对菌株降解毒死蜱的特性与降解机理进行了系统的研究；基于对菌株的全基因组测序及生物信息学分析，发现菌株YC-YH1中同时含有有机磷降解酶基因mpd和ophC2，含有编码鞭毛形成、细菌趋化性所需的全部基因，同时含有萘、菲等物质的降解途径中相关酶基因；通过荧光差异双向电泳分析菌株YC-YH1在毒死蜱胁迫条件下的蛋白质表达差异，利用MALDI-TOF对差异表达蛋白进行了鉴定与系统的分析；进一步对差异表达蛋白进行了荧光定量PCR验证，发现有机磷水解酶MPH和OPHC2均为诱导表达；通过体外表达，获得MPH与OPHC2重组蛋白，对酶的特性、降解机理进行了系统的研究；基于基因组注释，克隆了调控蛋白基因，并对这些调控蛋白进行了表达与纯化，利用Biacore生物大分子相互作用系统筛选mpd基因的调控蛋白，获得了能与mpd基因启动子序列相互作用的调控蛋白LysR1661，同时通过凝胶阻滞验证了该蛋白与mpd启动子区结合的特异性。.主要研究结果包括：①对毒死蜱降解菌施氏假单胞菌YC-YH1对毒死蜱的降解特性与机理进行了系统的研究；②获得参与毒死蜱降解的相关基因mpd和ophC2及mpd基因的调控蛋白基因；③对mpd和ophC2的蛋白特性进行了系统的分析；④对mpd基因调控蛋白LysR1661进行了初步的验证与分析。.此项研究为有机磷农药污染环境的生物修复提供了菌株与基因资源；对于降解酶基因mpd与ophC2的系统研究为深入阐述菌株对毒死蜱的降解机理提供了理论参考；本课题对于降解酶基因mpd的表达调控机制的研究为首次报道，为进一步揭示有机磷农药降解过程的调控机制奠定了基础，也为进一步通过定性改造等方法提高降解效率提供了理论基础。