油菜长发夹RNAi突变体库的构建及筛选

It is an urgent task that to mine and obtain genes related to the important agronomic traits with independent intellectual property rights, after the genomic sequencing work of rapeseed has been completed. And there are limitations on the gene functional analysis with multiple copies for the traditional T-DNA insertion mutant libraries and the physical and chemical mutagenesis mutant libraries, however, the RNAi mutant librariy, as a new means of functional genomics research, can overcome these shortcomings. The applicant has succeeded in suppressing the expression of flower development-related AP2 gene via intron-mediated long hairpin RNA (lhRNA) with 75% interference efficiency for transgenic plants in rapeseed. In addition, the research team of the applicant has generated a good rapeseed genetic transformation platform with a high transformation efficiency (about 19%). And these provide technical support for the generation of the lhRNAi mutant library of Brassica napus. In this study, cDNA library fragments were converted to the hairpin RNAi library through Rolling circle amplification-Mediated Hairpin RNA system (RMHR system). And then the genome-wide lhRANi mutant library was constructed by means of large-scale genetic transformation in Brassica napus, providing a platform for functional genomics research of rapeseed, opening a novel high-throughput gene mining system adapted to polyploid species.

油菜的测序工作已经完成，开发、挖掘重要农艺性状相关的基因是亟待攻克的任务。鉴于油菜是异源四倍体，基因存在多拷贝，传统的T-DNA插入及物理化学诱变突变体库在对基因家族和多拷贝基因的功能分析上存在局限性，而RNAi突变体库则可克服上述突变体库的不足。申请者前期借助内含子介导的长发夹RNA，在油菜中成功对花发育相关基因AP2进行干扰表达，干扰效率达到75%；此外，申请者所在科研团队创建转化效率达19%的高效油菜遗传转化平台，为创制油菜lhRNAi突变体库提供技术支持。本研究中，拟借助滚环复制介导的发夹RNA构建（RMHR）系统，把片段化cDNA文库转化为发夹RNAi文库，对油菜进行大规模遗传转化，在基因组范围创制油菜lhRANi突变体库，筛选重要功能基因，探索 RMHR 系统和 RNAi 文库在油菜基因大规模鉴定中的有效性，为油菜功能基因组研究提供平台，开辟一种适应于多倍体物种的高通量基因挖掘

油菜作为重要的油料作物，庞大的基因组测序工作已完成，大量基因等待着人们去诠释其功能。转座子插入、化学诱变、物理诱变等突变体库产生方法也已成功应用在功能基因的挖掘中，在功能基因的挖掘中起到了重要的作用，但目前大部分的基因功能仍然未能解析，这与上述突变体库存在的一些缺点有关。鉴于油菜是异源四倍体，基因存在多拷贝，限制了上述突变库构建在油菜中的应用。本项目基于目前油菜的测序工作已经完成，通过反向遗传学途径，利用简单高效RNAi方法和技术创建新型油菜lhRNAi突变体库，解决T-DNA插入突变、物理化学诱变等传统的突变体库应用在多倍体物种的局限性，为多倍体物种的功能基因组学研究提供新的借鉴。本研究通过滚环复制的方法构建了甘蓝型油菜lhRNAi文库，并对这种新型的干扰文库进行质量评估；然后将该lhRNAi文库对甘蓝型油菜进行遗传转化，获得763株遗传转化T0代植株，从中鉴定分离出74株具有可见表型变异的花发育相关突变体，包括花瓣减少、形状异常，柱头卷曲，雄蕊退化萎缩，雄性不育（不能产生花粉）、死蕾或花蕾闭合等。说明通过滚环复制介导的lihRNAi文库的构建方法可以成功应用到油菜中，这将为油菜功能基因组的研究提供重要的研究平台。