拟南芥ENO2基因编码的选择性翻译蛋白（ENO2和MBP-1）在生长生殖发育和抗盐中的功能研究

ENO2 is a multifunctional gene encoding two proteins (ENO2 and MBP-1) that can be selectively translated in Arabidopsis thaliana. It has been studied that the absence of ENO2 gene causes the defective growth and reproduction of plant, i.e., smaller plant, reduced germination rate of pollen, and shorter silique. Previous studies focused on the overall functions of ENO2 gene. However, the two selective translated proteins of ENO2 gene, ENO2 and MBP-1, are not comparatively studied. In particular, the functions of ENO2 and MBP-1 in growth, reproductive development, and their regulatory pathways are unclear. On the basis of previous researches, this project will research the functions of ENO2/MBP-1 and its coding sequence (ENO2-only/MBP-1) in plant growth, reproductive development and response to salt stress, including the related regulatory mechanism, from multi-levels (i.e., phenotype, transcriptome, and proteome). Results from this project will also reveal the target genes regulated by MBP-1 and the mechanism of entering into the nuclear , and provide a new clue to the regulatory network and molecular mechanism of stress response in plants, and provide candidate gene for crop breeding.

ENO2是一种多功能基因，编码可选择性翻译的两种蛋白（ENO2和MBP-1）。ENO2基因缺失导致植物生长和生殖发育缺陷，植株变小，花粉萌发率下降，角果变短。以前的研究主要集中在ENO2基因的整体功能，尚未见将它的两种选择性翻译蛋白ENO2和MBP-1区分开进行比较研究的报道，其在植物生长、生殖发育及其调控通路中的作用仍不清楚。本项目拟在前期研究基础上，从多层次水平（表型、转录组、蛋白质组）研究ENO2/MBP-1及其编码序列（ENO2-only/MBP-1）在植物生长、生殖发育和盐胁迫响应中的功能及其调控机制，并揭示MBP-1转录调控的靶基因及入核机理，为深入认识植物在逆境胁迫响应的调控网络和分子机制提供新的线索，为作物育种提供抗逆候选基因。

众所周知，烯醇化酶ENO2的主要功能是参与糖酵解过程，近年来的研究发现拟南芥ENO2 基因还影响植物生长发育和非生物胁迫等，然而，其具体的基因功能及调控机制还亟待研究。本项目旨在前期研究工作的基础上，利用已获得的eno2-突变体、eno2-/35:AtENO2-GFP、WT等拟南芥株系，借助光学显微镜及统计学等技术和方法从萌发率、主侧根根长、花粉发育、角果大小、种子大小和质量、种皮颜色、油脂含量和气孔开度等表型展开对AtENO2基因的功能研究。主要研究工作包括：（1）将AtENO2基因启动子序列系列截短，探究启动子序列中存在的特异性结合元件，并对其功能进行探究；（2）利用转录因子库筛选ENO2/MBP-1的互作蛋白，并通过酵母双杂交、 Pull-down、双分子荧光互补实验（BiFC）等进行蛋白互作分析，从而揭示AtENO2调控种子大小和质量、种皮颜色和油脂含量的机制；（3）借助原核表达、体外磷酸化等多种方法，分析ENO2在ABA诱导气孔关闭信号通路中发挥重要功能的特异磷酸化位点;（4）利用生信及生化等多种手段筛选特异磷酸化位点的蛋白激酶；（5）借助小RNA测序、转录组学、蛋白质组学等生信手段、及各生理指标检测来探究AtENO2基因影响种子萌发的分子机制。项目研究结果表明，AtENO2基因突变将导致种子萌发率下降、角果变短、种子变小、种皮颜色变浅、脂肪酸含量增加等；在启动子序列中，发现一个特异性结合元件G10（GTGANTG10），阐明了AtENO2基因调控花粉内壁发育的机制；ENO2与bZIP75/ TGA5均发生互作，分别调控拟南芥种子的大小和质量，及种子中脂肪酸的生物合成；发现并鉴定出1个在ABA诱导气孔关闭信号通路中发挥重要生物学功能的磷酸化位点，筛选并验证了该特异磷酸化位点的蛋白激酶；在盐胁迫下，AtENO2通过影响与植物激素信号转导途径、胁迫响应因子和活性氧相关的基因表达，调控种子萌发。通过本项目的研究，系统分析了ENO2基因在拟南芥生长发育中的作用，揭示了ENO2基因及其启动子，和蛋白磷酸化修饰在植物生长发育及响应逆境胁迫中的功能和调控机理，为植物抗逆育种提供了理论依据以及具有自主知识产权的新基因资源。