果糖激酶对瓜类异属间嫁接亲和特性的指示作用和调控机理

Grafting is the most distinctive technique for Cucurbitaceae cultural practice, and it is also the main way for the effects study of rootstock on characters of scion. Little was known about the biochemical basis for compatibility, which limited the proceeding of incompatibility conquering and widens the selection range of rootstock in Cucurbitaceae by gene or protein engineering methods. In our research the Semi-Quantitative RT-PCR, Real-Time Quantitative PCR and Multiple Reaction Monitoring (MBM) will be used to verify the indication of fructokinase on graft compatibility in twelve heterograft combination of Cucurbitaceae based on the earlier study results. The over expression vector of fructokinase will be constructed and introduced into rootstocks by Agrobacterium-mediated transformation. The compatibility analysis of transgenic rootstocks will be performed to verify the regulatory function of fructokinase on graft compatibility. The results will first verify and explain the indication and regulatory of fructokinase on graft compatibility in Cucurbitaceae at gene and protein level, and give support to the further research on the investigation of enzyme agent for the incompatibility conquering and widens the selection range of rootstock in Cucurbitaceae.

嫁接是瓜类生产极具物种特色的重要栽培技术，也是研究砧木对接穗影响的重要手段。然而，嫁接亲和性分子生化机理尚不明确，限制了利用分子生化手段克服瓜类异属间嫁接不亲和性、拓宽砧木选择范围的应用进程。本项目拟在前期瓜类异属间嫁接亲和蛋白质谱鉴定的基础上，针对目的蛋白果糖激酶，扩大检测验证样本，配置多组瓜类嫁接亲和组合，利用半定量RT-PCR、实时定量PCR技术和多重反应监测技术（MRM），证实果糖激酶对瓜类嫁接亲和特性的指示作用；通过构建果糖激酶过表达载体，建立砧木瓜类作物农杆菌介导遗传转化体系，比较果糖激酶过表达砧木的嫁接亲和性变化，明确果糖激酶对瓜类异属间嫁接亲和特性的调控功能。研究结果将首次在基因和蛋白水平证实和解释果糖激酶对瓜类异属间嫁接亲和性指示作用和调控功能，为植物嫁接亲和性分子生化机理研究提供参考，为利用酶作用剂调控瓜类异属间嫁接亲和特性及通过嫁接改良接穗性状提供强有力的技术支持。

为了利用果糖激酶改善瓜类嫁接不亲和特性，开展果糖激酶基因表达和转基因功能验证研究。取得以下结果：1、以西瓜和印度南瓜下胚轴、愈伤组织和嫁接体为试材，应用荧光定量PCR技术，经过GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析，确定ACT和TUA是西瓜/印度南瓜亲和过程中表达稳定的内参。根据西瓜（W）、甜瓜（M）和印度南瓜（A）果糖激酶基因CDS序列设计筛选qRT-PCR引物，以ACT为内参，分析果糖激酶基因在W/A和M/A嫁接体第5天和第20天的表达量，结果表明，在W/A和M/A嫁接亲和过程中果糖激酶均表现为上调表达，表达规律一致，在W/A增幅大，在M/A增幅小。表明果糖激酶基因可用于瓜类异属间嫁接亲和过程的指示物。2、以4-7天的葫芦南瓜无菌苗子叶为外植体，选择作物诱导子叶再生常用细胞分裂素（6-BA、ZT、TDZ、KT和2,4-D）、生长素（NAA和IBA）、以及赤霉素（GA3），设置浓度梯度，利用正交设计和析因设计设置22种培养基筛选南瓜和葫芦子叶再生最佳激素。结果显示6-BA和TDZ对南瓜子叶愈伤诱导效果佳，ZT和KT不适用，最终确定Df1（1 mg/L TDZ+1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L IBA）为南瓜子叶愈伤诱导最佳培养基。细胞分裂素（6-BA、ZT、TDZ和KT）对葫芦子叶保持绿色和分化能力作用不明显，最终确定Df11（0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L NAA）为葫芦子叶愈伤诱导最佳培养基。GA3对南瓜和葫芦子叶均没有愈伤诱导作用。后续调整TDZ、6-BA和IBA、NAA用量，没有获得南瓜和葫芦子叶愈伤的再生苗。3、以黄瓜果糖激酶CDS序列（Csa6M080910.1）为目的片段，利用双酶切法和T4连接酶构建pCAMBIA1300改-PFK过表达载体。4、确定葫芦和南瓜子叶侵染方式和共培养时间为：利用OD600值为0.3的农杆菌菌液侵染子叶5-10min，沥干菌液，直接接种，共培养4-6天；确定葫芦子叶比南瓜子叶对潮霉素敏感，可以根据葫芦和南瓜子叶再生时间、以及半致死量选择潮霉素筛选浓度，葫芦子叶的半致死量是75 mg/L潮霉素培养10天，南瓜子叶是50 mg/L潮霉素培养20天达到半致死。共培养4天的外植体可使用300 mg/L 羧苄青霉素抑制农杆菌生长。