用于2型糖尿病研究的GIPRdn转基因广西巴马小型猪模型制作

The suitable animal model is very important for study on human disease.The Guangxi Bama mini-pig is a famous experimental mini-pig breeds. A human dominant-negative GIPR (GIPRdn) gene was inserted into the lentiviral vector which its CMV has been replaced by rat insulin gene promoter (RIP2), constructing the recombinant lentiviral vector, and transfecting 293FT cells for recombinant lentivirus preparation. The zygotes of Guangxi Bama mini-pig were produced with superovulation. The recombinant lentivirus was injected into the perivitelline space of zygotes of mini-pig with microinjection. Embryos were transferred into synchronized recipients. Offspring were genotyped by PCR and Southern blot analysis. The concentration of blood glucose and serum insulin was monitored, oral and intravenous glucose tolerance test was conducted, GIPRdn expression was detected by RT-PCR, proliferation and apoptosis rates of β cells were determined by double immunohistochemical. The GIPRdn transgenic Guangxi Bama mini-pigs were produced for type 2 diabetes research in this project.

合适的动物模型是人类疾病研究的重要基础。广西巴马小型猪是我国著名的实验用小型猪品种。本项目将人显性抑制GIPRdn基因插入经用大鼠胰岛素基因Ins2启动子（RIP2）替换CMV启动子的慢病毒载体中，构建重组慢病毒载体，转染293FT细胞制备重组慢病毒；超数排卵处理广西巴马小型猪生产受精卵；利用显微注射技术将重组慢病毒注射入小型猪受精卵透明带下空隙，胚胎移植入同情发情的受体母猪；仔猪采用PCR和southern bolt进行转基因阳性鉴定；监测阳性转基因猪血糖、血清胰岛素的浓度变化，开展口服和静脉注射糖耐量试验；RT-PCR检测阳性转基因猪胰腺GIPRdn基因表达，免疫组化分析胰岛β细胞增殖和凋亡。项目研究建立GIPRdn转基因广西巴马小型猪，为2型糖尿病研究提供合适的动物模型。

2型糖尿病已经成为影响人们身心健康的主要疾病之一，其发病过程复杂，发病机制尚不完全清晰。合适的动物模型是研究人类疾病的重要基础。项目研究目的是利用转基因技术构建广西巴马小型猪2型糖尿病模型，用于研究T2DM发病的分子机制。项目实施，根据人葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽受体基因（GIPR），设计、合成人缺陷型GIPRdn基因序列，长1377bp，与GIPR序列对比，GIPRdn基因序列缺失了第955~978位24个碱基，地1019~1020位的CT碱基突变为AG；克隆出大鼠胰岛素2基因启动子序列（RIP2），长703bp，细胞实验表明，RIP2能在βTC-6细胞中特异性的启动基因表达；构建出胰岛特异性表达载体pLV-RIP2-GIPRdn，包装出携带RIP2-GIPRdn序列的慢病毒，病毒滴度为2×107 TU/mL，将慢病毒感染βTC-6细胞试验，QRT-PCR和Western blot检测表明，导入GIPRdn能显著抑制GIP诱导的下游基因PDX-1、CREB的表达，进而减少细胞的胰岛素分泌水平；建立了广西巴马小型猪胎儿成纤维细胞系，将构建的pcDNA3.1-EGFP-PIP2-GIPRdn质粒导入成纤维细胞，筛选获得携带PIP2-GIPRdn序列的单克隆阳性细胞系；通过显微注射法、手工克隆法和体细胞核移植等方法，生产转基因胚胎1040枚，手术法移植受体母12头，早期检测怀孕4头，但未能获得活体的转基因猪。项目研究结果对后续构建巴马小型猪转基因疾病模型打下工作基础。