肺炎链球菌锌离子摄取关键脂蛋白AdcA和AdcAII金属结合特性的研究

Zinc is an essential element for bacterial survival and infection to host. The zinc uptake system on cell surface is vital to bacterial virulence. Previous studies found that two lipoproteins AdcA and AdcAII, which are located on the cell surface and anchored to the cell membrane, were responsible for zinc uptake in Streptococcus pneumoniae.. This project will clone, express and purify two AdcA and AdcAII proteins. Fluorescence, UV-Vis, Circular dichroic spectroscopy, Stop-flow and other biophysical and biochemical methods will be applied to characterize the thermodynamics and kinetics properties of metal binding and release of AdcA and AdcAII, to study the effects of metal on protein conformation, and to analyze the difference and the preference in zinc transport of two proteins. Site-mutagenesis, NMR and in vivo experiments will analyze the roles of key amino acids in metal binding. At a suitable condition, proteins will be crystallized and their structure will be solved. We will study the relationship between the structure and function, and further elucidate the molecular mechanism of zinc uptake in Streptococcus pneumoniae. These results will provide new clues for the study of bacterial zinc transport mechanism and important theoretical basis for development of new vaccines and anti-bacterial drugs.

锌离子是细菌赖以生存和对宿主形成感染的必需元素，因此位于细胞表面的锌摄取系统也直接决定了细菌的毒力。研究发现在肺炎链球菌表面，主要是两个脂蛋白AdcA和AdcAII锚定于细胞膜上负责从外界摄取锌离子。. 本课题拟对两种锌摄取蛋白进行克隆、表达和纯化；利用荧光光谱、紫外光谱、圆二色光谱以及停留等多种生物物理和生物化学的研究手段，交叉组合表征锌摄取蛋白的金属结合及释放的热力学和动力学特性，研究金属结合对蛋白构象的影响，分析二者的异同以及在锌转运过程中的优先性；结合定点突变技术和核磁共振技术及体内功能验证等研究关键氨基酸残基的作用；在条件合适的情况下，尝试结晶蛋白质并解析结构，分析其结构与功能的关系，进而阐明AdcA和AdcAII介导的肺炎链球菌的锌摄取分子机制。本课题的成果将为研究细菌中锌离子运输提供重要的新思路，同时为开发基于锌摄取蛋白的新疫苗和抗菌药物提供重要理论基础。

锌离子是细菌生存和感染的关键元素。因此位于细胞表面的锌摄取系统也直接决定了细菌的毒力。研究发现在肺炎链球菌表面，主要是两个脂蛋白AdcA和AdcAII锚定于细胞膜上负责从外界摄取锌离子。.本课题通过进化分析发现在大多数细菌体内都具有AdcA的同源蛋白，但大部分都是单结构域的小分子量蛋白质，这可能是由于小蛋白的生物合成效率更好。然而，我们发现具有两个锌结合位点的双结构域蛋白AdcA显著富集在链球菌属中，其中许多是感染人体的病原菌。热力学和动力学实验表征发现N端对于锌的亲和力比C端强，结合速率也比较快；分子动力学模拟（MD simulation）显示AdcA的N端和C端结构域结合锌可以先后稳定其三维结构，并形成一个域间接触面，这些都是保证增加蛋白对锌的亲和力和传输速度的基础。这种特殊的双结构域赋予链球菌属在锌稀缺的情况下具有明显的锌转运优势，这是AdcA单结构域同源蛋白所不具有的。在链球菌中AdcA凭借双结构域的优势在锌离子结合速率方面较AdcAII 快两个数量级，因此在锌离子摄取过程中发挥主要作用，而AdcAII发挥次要作用，推测其在细菌缺锌情况下作为补充转运通路。AdcAII本身作为双功能蛋白既可以结合层黏连蛋白，也可以转运锌离子和锰离子。深入研究AdcA和AdcAII介导的锌锌转运机制为研发抗链球菌药物提供了潜在目标。