纤维素酶基因的定向进化及在乳酸杆菌中的高效表达

Cellulose is the most abundant polysaccharide substances, existing widely in straw and other agricultural products. However, using straws as an animal feed is limited by poor taste and low digestibility. In this study, cellulase gene with high activity in the acidic condition will be screened out by DNA direct evolution technology, and then connect the gene and strong promoter with pIAβ8 plasmid which can efficiently express exogenous gene in Lactobacillus. the plasmid is transferred into Lactobacillus. The transgenic Lactobacillus can produce a lot of cellulase to degradation the cellulose during straw microbial fermentation, which can solve the the problem that the current microbial silage additive can''t decompose the cellulose and can''t improve the nutrient utilization in straw. At last, the effect of transgenic Lactobacillus on straw utilization and animal production will be studied through microbial silage of straw.

纤维素是地球上最丰富的多糖物质，广泛存在于秸杆等农副产品中，但是秸秆作为饲料适口性差、消化利用率低，从而限制了其在动物生产中的应用。本研究首先对纤维素酶基因进行定向改造，筛选出可在酸性条件下产生高活力纤维素分解酶的基因；把该基因与强启动子一起连于可在乳酸杆菌中高效表达外源基因的pIAβ8质粒上，构建高效表达的载体；然后转入到可在秸杆微贮过程中大量生长和繁殖的乳酸杆菌中。这样在转基因乳酸杆菌大量繁殖的同时，可产生大量的纤维素酶来分解秸杆中的纤维素，从而解决当前的秸杆微贮添加剂不能分解秸杆中纤维素及不能提高秸杆中营养物质利用率的严重弊端。最后，通过秸秆微贮来研究转基因乳酸杆菌在提高秸秆的利用率和动物生产性能方面的作用。

纤维素是地球上最丰富的多糖物质，广泛存在于秸秆等农副产品中，但是秸秆作为饲料适口性差、消化利用率低，从而限制了其在动物生产中的应用。本项目利用DNA改组的方法筛选出酶活较高的酸性纤维素酶基因，并将纤维素酶基因转入到乳酸杆菌中，当转基因的乳酸杆菌在秸秆中大量生长和繁殖的同时，可分泌大量的纤维素酶，从而达到分解秸秆中纤维素的目的。. 本研究首先克隆出纤维素酶活较高的康氏木霉和黑曲霉的纤维素外切酶（CBH1）基因，经测序证实获得了包含信号肽的完整的纤维素酶基因（CBH1）全序列，基因全长分别为1626 bp和1515 bp，和NCBI上相关纤维素外切酶基因的同源性均在92%-100%之间。其次，将纤维素酶基因（CBH1）进行改组筛选出两个改组基因；再将改组基因与表达载体pMG36e相连，最后通过高压电击手段将重组质粒转化至植物乳酸杆菌中，经菌液PCR、质粒提取和双酶切验证，证明改组后的纤维素酶基因已成功转入植物乳酸杆菌中。第三，最优的转纤维素酶基因植物乳杆菌，在含有5%玉米秸秆粉且不含葡萄糖的MRS培养基中静置培养6 d 后，其中纤维素酶活力（CMC酶）、葡萄糖浓度、半纤维素降解率和纤维素降解率分别比原始的植物乳杆菌提高8.68%、16.14%、28.38%和10.05%（P<0.05）。