基于氧化石墨烯荧光传感技术对中药海马的鉴定研究

Origin identification of Chinese material medica is essential for the quality control of traditional Chinese medicine. Hippocampus, the valuable traditional Chinese medicines, is of high medicinal value and price. Market research found that there were very many adulterants of Hippocampus in medicine market. Most of adulterants are endangered rare wild animals, and their pharmacological function is unknown. Due to the high similarity between the true medicine and fake medicine, it is very difficult to distinguish the medicinal materials using traditional identification method. The existing molecular identification methods also have deficiencies. Fluorescent sensing technology based on the unique properties of graphene oxide has been successfully used to detect nucleic acids. In view of excellent fluorescence quenching efficiency of graphene oxide and its different adsorption capacity to single/double-strand DNA, this project takes the lead in applying the graphene oxide-based fluorescence sensing technology to traditional Chinese medicine appraisal realm. In our preliminary studies, we used DNA barcoding technique and SNP locus to identification seahorse species. This study intends to screen and design specific primer according to these loxp sites of DNA barcoding sequences, label specific forward or reverse primer with a fluorescent dye as nucleic acid probe, structure nucleic acid probe graphene oxide-based fluorescent biosensor, explore the detecting condition of fluorescence spectrum, and then establish a new identification method for seahorse medicinal materials based on graphene oxide fluorescence sensing technology. This study also supplies a reference for the authentication of other traditional Chinese medicine.

中药品种鉴定是中药质量控制的首要环节。海马作为我国传统名贵中药，具有药用价值高，价格昂贵的特点。市场调查发现，海马市售品种混乱，混淆品药效不明且多为濒危珍稀野生动物。海马正品与伪品种间相似程度高，采用传统鉴别手段难以有效区分，现有分子鉴定方法也存有不足。基于氧化石墨烯独特性质的荧光传感技术已成功用于检测核酸。本课题鉴于氧化石墨烯优异的荧光淬灭效率及其对单链/双链DNA吸附能力的差异，率先将氧化石墨烯荧光传感技术借鉴到中药鉴定领域中来：在前期自然基金利用DNA条形码和SNP位点鉴定市售海马品种的研究基础上，拟利用海马条形码序列中的特异位点，筛选设计特异性引物，荧光染料标记特异性上游或下游引物作为核酸探针，构建海马药材特异性核酸探针-氧化石墨烯荧光传感器，摸索荧光光谱检测海马药材的条件，建立基于氧化石墨烯荧光传感技术鉴定海马药材的新方法，也为其它中药材的鉴定提供了一条可借鉴的新途径。

海马是我国传统名贵中药材，药用价值较高，市场需求量大，价格昂贵。市售海马混淆品占的比例较大，严重影响了临床用药的安全性和有效性。不同海马形态差异不明显，显微结构和化学成分也高度相似，传统鉴别手段难以有效区分正品和伪品，现有分子鉴别方法也有缺陷。目前，氧化石墨烯荧光传感技术已成功用于检测核酸。本课题鉴于氧化石墨烯优异的荧光淬灭效率及其对单链/双链DNA吸附能力的差异，将氧化石墨烯荧光传感技术借鉴到中药鉴定领域中来：课题组收集了市售的海马药材，根据形态特征结合DNA条形码技术鉴定出市售海马品种有13个。对13种海马的COI序列进行比对，发现多个SNP位点，基于SNP位点，设计了小海马的特异性引物，在其特异性上游引物 Ja-F 的 5’端标记荧光基团 FAM 作为核酸探针 FAM-ssDNA（单链 DNA），在下游引物Ja-R 的 5’端加上 RNA 聚合酶 II 的识别位点记为 Ja-R1，用 Ja-F/ Ja-R1 扩增海马样品，利用体外转录法对扩增产物进行反转录获得小海马 ssDNA。取 20μL FAM-ssDNA （500 nmol/L），90 ℃孵育 5 min，冷却至室温，加入120μL氧化石墨烯溶液（100 mg/L ） 和 860μL Tris-HCl（pH 7.6, 50 mmol/L）使反应终体积为 1 mL，混匀，室温放置 20 min，可彻底淬灭探针荧光。以上结果表明构建鉴别小海马的核酸探针-氧化石墨烯生物传感器条件为：1 mL 反应体积中 ，10 nmol/L FAM-ssDNA+12 mg/L 氧化石墨烯溶液，室温避光反应 20 min。传感器可行性检测显示，当向传感器溶液中加入探针互补序列溶液（终浓度 90 nmol/L），室温反应 1 h 后，体系的荧光信号明显增强。灵敏度检测显示，该方法能够检测到的小海马 ssDNA 的最低浓度约为10 mg/L。将该方法用于检测市售海马药材，发现只有小海马样品有明显的荧光信号。本课题建立了基于氧化石墨烯荧光传感技术鉴定中药海马的方法，为中药鉴定提供一个新的研究思路。