大豆转录因子SNAC的无序序列区对耐盐相关基因表达调控的分子基础

NAC transcription factors play important roles in the regulation of biotic and abiotic stresses. Soybean salt-related transcription factor SNAC belongs to the intrinsically disordered regions（IDRs）protein, is intrinsically disordered in the C-terminal transcription regulatory domains (TRDs). It is still unclear how the C-termini to regulate the transcription factor activity of SNAC. Here, SNAC (and its C-terminal）will be used as a bait to screen a salt-stress-induced cDNA library by using the yeast two hybrid assay; The site mutation of the motif involving in protein-binding was made to increase the degree of protein structure. Next, the influence of the structure change to protein interactions will be deter-mined by CD spectrum and isothermal titration calorimetry; SNAC and SNAC without motif or with site-mutation motif were over-expressed in Arabidopsis thaliana. The transcription regulatory function of C-terminal motif involving in protein-protein interactions to salt resistance will be determined. In conclusion, this study plans to display the relevance among NAC protein sequence, structure and function in salt tolerance and elucidate the molecular basis of SNAC transcription regulation activity from the perspective of intrinsically disordered proteins.

NAC转录因子在植物逆境响应中发挥重要调节作用。我们已获得大豆耐盐转录因子SNAC，C端为转录调节区，呈高度无序状态。然而，C 端如何参与NAC 转录调控活性尚不清楚。本项目将以大豆SNAC转录因子（及C端）为诱饵，从经盐胁迫大豆cDNA文库筛选与其互作蛋白，分析C端与受体蛋白的互作及其功能活性。再将SNAC因子C端基序缺失/点突变，旨在提高该肽段有序性；经CD和等温滴定量热法测定C端保守基序突变前后、二级结构表征改变与受体蛋白相互作用的关系。将SNAC基因、含缺失／经突变基序的SNAC基因转化拟南芥，分析转基因拟南芥表型及耐盐性状改变。综合上述结果，确定SNAC转录因子C端序列的无序性、二级结构、胁迫条件等因素对SNAC蛋白互作受体蛋白结合的影响，揭示SNAC因子C端的“序列-二级结构（构象）-功能”的关系，从无序蛋白角度阐明SNAC因子对基因转录调控的分子基础。

转录因子NAC是一类植物特有的抗逆相关转录因子,其N端为保守的NAC结构域，C端为无序的转录调节区。关于转录因子NAC无序序列区在植物抗逆信号通路中的作用尚不清楚。RCD1(radical-induced cell death1)是重要的转录因子调节子，属于植物SRO(similar to rcd one)蛋白家族。研究表明SRO蛋白家族参与植物正常生长发育,同时是多条抗逆信号通路的重要成员。目前关于大豆GmRCD1的功能及其在响应非生物胁迫中的潜在作用尚不清楚。因此研究GmRCD1与哪些转录因子NAC互作，哪些保守结构域介导了相互作用，在此基础上分析转录因子NAC如何利用其无序序列区与GmRCD1互作调控植物抗逆具有重要的理论及实践意义。.我们利用酵母双杂交系统证明NAC82蛋白可以与RCD1蛋白发生相互作用。利用原核系统表达GmRCD1与GmNAC82蛋白，GST Pull-down实验证明二者在体外能发生直接的相互作用。双分子荧光互补实验（BiFC）和亚细胞定位实验证明GmRCD1与GmNAC82在植物细胞核中发生互作。通过酵母双杂交系统筛选到17个与GmRCD1抗逆相关候选互作蛋白，并选择5个候选互作蛋白进行了基因全长的回转验证。为了鉴定GmNAC82与GmRCD1互作位点，我们对GmNAC82进行了生物信息学分析，依据筛库实验结果和GmNAC82无序序列区序列特征，设计引物获得了GmNAC82无序序列区的不同缺失克隆。依据GmRCD1序列特征，设计引物获得了GmRCD1的不同保守结构域克隆。通过酵母杂交实验确认GmNAC82利用其无序区内的288-323基序与GmRCD1保守结构域RST互作。此外，与野生型植株相比，过表达NAC82全长和NAC82（1-287）的拟南芥植株大小和颜色均更好，说明NAC82蛋白可能具有抗盐胁迫的功能。此外，过表达NAC82（1-287）的植株比NAC82全长的植株表现出更好的耐盐性，这说明RCD1可能通过与NAC82蛋白的相互作用负调控其耐盐功能。本项目的研究结果有助于我们进一步了解转录因子NAC和枢纽蛋白RCD1调控植物抗逆的分子机制。