miRNA-21调节PTEN和RhoB表达及其在创伤后神经元和脑血管内皮细胞损伤修复中的作用和机理研究

Traumatic brain injury (TBI) is an important public health problem. We found that the expression of miRNA-21 and RhoB after TBI and the phosphorylation of PTEN were associated with neuron apoptosis and the permeability of the blood brain barrier. However, the impact of miRNA-21 on neurons and cerebral vascular endothelial cells has not been elucidated. We postulated that miRNA-21 plays an important role in neurovascular restoration after TBI via the regulation of PTEN and RhoB expression. To verify this hypothesis, we will observe the expression of miRNA-21 at the tissue and cellular levels. The pre-sequence and reverse complementary sequence of miRNA-21 were synthesized first, and then regulate miRNA-21 via Lentivirus transfection. This study is to evaluate the changes in the PTEN and RhoB pathways at different miRNA-21 levels, and the impact of the changes on the structure and function of neurons and cerebral vascular endothelial cells. The project will not only observe neuron restoration after injury via miRNA-21 regulation but also focus on the restoration of cerebral vascular endothelial cells, in order to achieve a better synergistic effect, thereby we can find new treatment strategies for neurological function restoration after TBI.

创伤性脑损害（TBI）是严重的公共健康问题。课题组前期发现，miRNA-21、RhoB在TBI后表达变化及PTEN磷酸化与脑细胞凋亡及血脑屏障通透性关系密切，但miRNA-21对创伤后神经元及脑血管内皮细胞的确切作用和机理尚未阐明。我们推测，颅脑创伤后，miRNA-21通过调控PTEN和RhoB表达，启动下游通路，共同影响神经和血管的损伤修复。为验证此假说，本项目分别从组织和细胞水平观察不同损伤程度下miRNA-21表达变化，进一步通过合成针对miRNA-21的pre序列及其成熟体反向互补序列，构建慢病毒载体，利用病毒转染调控miRNA-21水平，观察其对PTEN、RhoB及下游通路的影响，并探讨上述变化对神经元及脑血管内皮细胞结构功能的影响。本课题不仅观察miRNA-21调控创伤神经元功能修复，更聚焦于脑血管内皮细胞损伤修复，期望达到更好的协同效果，为创伤后神经功能修复寻找新的治疗策略。

创伤性颅脑损伤是青年人主要致死病因，具有高发病率和高致死致残率的特点，至今的临床救治仍是巨大的医学挑战。在前期的研究中，我们初步探讨了在大鼠液压脑损伤模型中，PTEN抑制剂可促进PTEN磷酸化，磷酸化PTEN作为PTEN的失活状态可降低血脑屏障的通透性，减少细胞凋亡，改善伤后早期动物的神经功能，miRNA-21与RhoB的表达和PTEN的磷酸化关系密切。本课题中，我们在活体水平建立了控制性皮层损伤模型和离体条件下建立机械性牵张损伤模型，同时制备了miRNA-21过表达、封闭及其对照慢病毒，并建立了活体和离体（原代神经元和bEnd.3）稳转模型。活体和离体病毒转染损伤模型提示miRNA-21作用于下游靶点PTEN和RhoB，并与其呈负相关。我们发现，在活体水平，小鼠脑实质注射病毒转染建立皮层损伤模型后，过表达miRNA-21可减少Bax、Cl-caspase3凋亡因子的表达，从而减轻脑外伤发生后内皮细胞和神经元的凋亡、血脑屏障的破坏、脑水肿以及神经功能障；封闭miRNA-21则作用相反。与此同时，在离体水平，原代神经元细胞病毒转染建立机械性牵张损伤模型后，过表达miRNA-21可增加神经元的活性，减少NSE、S100B、Bax和Cl-caspase3的表达及细胞的凋亡；封闭miRNA-21则作用相反。此外，在离体水平，bEnd.3细胞病毒转染建立机械性牵张损伤模型后，过表达miRNA-21可增加细胞增殖，减少Bax、Cl-caspase3的表达和细胞凋亡，对细胞迁移的影响作用不大；封闭miRNA-21则作用相反。本课题为miRNA-21作为临床治疗创伤性颅脑损伤的靶点提供了理论依据和前期基础。