2-苯氧基苯甲酸微生物降解代谢的分子机制研究

Phenoxybenzoic acid (PBA) is an important chemical widely used in the synthesis of pesticides and chemical products. It is also the intermediate product of these chemical’s biodegradation. According to the position of the carboxyl group, PBA has three isomers: 2-PBA, 3-PBA and 4-PBA. To date, there were two angular dioxygenases PbaA1A2BC and PobAB, which could catalyze the cleavage of the ether linkage of 3-PBA and 4-PBA. However, PbaA1A2BC and PobAB could not degrade 2-PBA due to the position of the carboxyl group. And there was no report about the microbial degradation of 2-PBA by now. Bacteria strain Sphingobium sp. P2 could completely degrade and utilize 2-PBA, and the degradation of 2-PBA in this strain was initiated by cleavage of the ether linkage under the catalysis of an unknown angular dioxygenase. This project will try to study the metabolic pathway of 2-PBA in Sphingobium sp. P2, clone the angular dioxygenase gene pbaA2 catalyzing the cleavage of the ether linkage of 2-PBA through information analysis of the genome and transposon insertion mutation, the enzymatic characteristics, function and kinetics of Pba2, and the effect of the carboxyl position on the catalytic efficiency of the Pba2. The results of this program will provide the physiological, biochemical and genetic foundation of 2-PBA degradation in strain P2, elucidate the enzymatic mechanism of effect of the carboxyl group position on the biodegradability of PBA, and benefit the microbial remediation of PBA residue pollution.

苯氧基苯甲酸（PBA）是很多重要农药和化工产品合成原料，也是这些物质降解产物和限速步骤。根据羧基位置不同，PBA有三种异构体：2-PBA、3-PBA和4-PBA，因羧基位置影响，已报道催化3-PBA和4-PBA醚键断裂的角度双加氧酶PbaA1A2BC和PobAB不能降解2-PBA。迄今国内外还没有2-PBA微生物降解的报道。Sphingobium sp. P2可降解并利用2-PBA生长，已发现该菌通过一个未知的角度双加氧酶催化2-PBA醚键断裂。本项目研究P2降解2-PBA的代谢途径，通过基因组分析、转座子插入突变等技术克隆2-PBA角度双加氧酶基因pba2，研究Pba2的特性、动力学和关键活性位点，及羧基位置对Pba2催化效率的影响。本项目将揭示P2降解2-PBA的分子机制，为深入研究角度双加氧酶结构与功能，羧基位置影响PBA可降解性的酶学机制，及PBA污染微生物修复提供材料和理论依据。

苯氧基苯甲酸（PBA）是很多重要农药和化工产品合成原料，也是这些物质降解产物和限速步骤。根据羧基位置不同，PBA有三种异构体：2-PBA、3-PBA和4-PBA，因羧基位置影响，已报道催化3-PBA和4-PBA醚键断裂的角度双加氧酶PbaA1A2BC和PobAB均不能降解2-PBA。.本研究菌株可降解并利用2-PBA生长，降解的最适温度和最适pH值分别为30°C和pH7.0；随着菌株接种量的提高，2-PBA的降解率也相应提高；当2-PBA浓度大于等于300 mg·L-1时会对菌体生长产生抑制或毒害作用，2-PBA的降解率也相应降低。HPLC分析表明该菌株可将2-PBA降解为为苯酚和2,4-己二烯酸苯酚酯。除此之外，该菌株还能够降解二苯醚、苯酚、邻苯二酚、苯甲酸和2,3-二羟基苯甲酸，但不能降解对苯二酚、间苯二酚、3,4-二羟基苯甲酸，2,5-二羟基苯甲酸及2-PBA的同分异构体3-PBA和4-PBA。.通过建立突变文库、基因插入突变、回补、体外表达纯化、酶活检测、和转录水平分析等方面，我们验证了该菌株降解2-PBA的途径及关键酶基因：2-PBA在2-PBA双加氧酶的作用下在连接氧的碳原子及其邻位的碳原子上同时双加氧，2-PBA的羧基被脱去形成2,4-己二烯酸苯酚酯，随后2,4-己二烯酸苯酚酯在水解酶DpeD作用下水解生成苯酚和粘康酸半醛，苯酚在苯酚单加氧酶PheI的作用下在邻位单加氧生成邻苯二酚，邻苯二酚在邻苯二酚-2,3-双加氧酶CatH的作用下开环裂解产生2-羟基粘糠酸半醛，2-羟基粘康酸半醛在2-羟基粘康酸半醛脱氢酶CatI作用下脱氢生成2-酮-4-戊烯酸酯，2-酮-4-戊烯酸酯在2-酮-4-戊烯酸酯水合酶MhpD作用下生成4-羟基-2-酮戊酸。.通过查找基因注释关键词和序列比对以及基因外源表达，我们验证了该菌株可通过3-羟基苯甲酸4-羟化酶3Hba-4DO和4-羟基苯甲酸3-羟化酶4Hba-3DO分别在3-羟基苯甲酸（3-HBA）的4位和4-羟基苯甲酸（4-HBA）的3位单加氧，生成共同产物3, 4-二羟基苯甲酸，即原儿茶酸。.本项目从生理、生化和遗传角度揭示微生物降解2-PBA的机制，为深入研究角度双加氧酶结构与功能，羧基相对位置影响PBA可降解性的酶学机制，及苯氧基苯甲酸类化合物残留污染的微生物降解修复提供理论和技术依据。