Na+/H+交换泵对β-APP加工调控及在Alzheimer病发病机制中的研究

Alzheimer病中，淀粉样前体蛋白APP受到β分泌酶1（BACE1）和γ分泌酶在APP序列两侧裂解，产生Aβ，导致Aβ生成过多和沉积，被公认为是Alzheimer病的发病基础之一。然而，BACE1受到何种因素调控，尚不清楚。最近研究表明，BACE主要分布于细胞内酸性细胞器中，它的活性在pH值4.0-4.5时最大。Na+/H+交换泵（NHE）是调节细胞内pH的关键通道之一，前期工作发现，AD细胞模型中NHE1基因表达抑制，细胞内pH值下降，由此假设NHE1功能异常可能导致细胞内酸化，影响BACE1活性，诱发Aβ生成，导致AD产生。本课题利用AD动物模型，离体模型和体外细胞模型，从多重角度研究NHE1对BACE1的调控作用，通过药物抑制或knockdown NHE1，观察BACE1的表达及活性变化，以及对APP的剪切和Aβ的累积作用，为阐明NHE1在AD病理形成中的机制提供前期工作基础。

Alzheimer病中，淀粉样前体蛋白APP受到β分泌酶1（BACE1）和γ分泌酶在APP序列两侧裂解，产生Aβ，导致Aβ生成过多和沉积，被公认为是Alzheimer病的发病基础之一。本课题利用AD动物模型，离体模型和体外细胞模型，从多重角度研究NHE1对BACE1的调控作用，采用NHE1高特异性抑制剂cariporide抑制NHE1，观察对SH-SY5Y细胞株的影响。进一步采用siRNA方法抑制NHE1表达，观察BACE1的表达。用这两种方法造成的细胞内酸化模型中，均检测出BACE1和PS1的表达及活性较对照组明显升高。采用快速衰老小鼠品系SAMP8，对照相同品系正常小鼠SAMR1，给予NHE1抑制剂及神经保护剂FKBPs,（FK506 blinding proteins）配体噻嗪酰胺衍生物（HD5-6）进行干预，分别采用美国杨格公司的非损伤微测技术检测海马细胞膜H离子流速，采用Morris 水迷宫实验评价各组小鼠学习记忆能力的变化。水迷宫实验结束后，HE染色观察海马区神经元形态；TUNEL观察海马神经元凋亡情况；免疫组织化学法及免疫荧光染色检测相关蛋白在海马中的表达；用基因芯片技术检测各组小鼠海马神经元基因表达谱的变化差异，并通过RT-PCR进一步验证差异基因。H离子流速和小鼠海马中的细胞凋亡结果显示与SAMR1对照组相比较，SAMR1抑制剂组的结果差异不明显。与正常对照组相比，痴呆组及抑制剂干预组在定位航行实验中表现出明显的学习记忆障碍，逃避潜伏期显著延长；海马区神经元数量明显减少，细胞排列紊乱，大量的神经元细胞核固缩，深染、坏死，检测各组小鼠海马神经元基因表达谱的变化。使用Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression Microarray（8*60K）芯片进行检测。对于表达上调或者下调倍数变化值>2.0且P值< 0.05的mRNA进行归类分析。干预的小鼠与SAMP8小鼠海马神经元的表达差异在2倍以上的基因有118条，表达上调的为9条，表达下调的为109条。其中AQP4基因与AD发生中Aβ的清除有一定相关性。选取Aqp4基因行realtime-PCR，显示痴呆组AQP4基因表达量较SAMR1小鼠组增高，且结果有统计学意义，免疫荧光提示SAMP8组中AQP4表达增加。我们推测快速老化模型小鼠AQP4的高表达为代偿性表达增高