青枯菌效应蛋白Rip63与茄科作物GDP-L-半乳糖磷酸酶互作诱导植物抗病的分子机理

In response to the infection of Ralstonia solanacearum, Solanaceae plants produce a great deal of hydrogen peroxide, which is an important indicator of the resistance level of host plants. So far, the contribution of T3SS-dependent effector of R. solanacearum remains unclear for this hydrogen peroxide accumulation. Our previous work indicated that R. solanacearum GMI1000 effector Rip63 not only induces hypersensitive response (HR) reaction on Nicotiana benthamiana, but also promotes disease resistance in tomato plants. The yeast two-hybrid experiment demonstrated that effector Rip63 interacts with GDP-L-galactose phosphorylase (GGP), a key catalytic enzyme involved in the biosynthesis of ascorbic acid. In addition, Rip63 induces a quicker HR reaction on GGP silent tobacco mediated by VIGS. Those results suggest that GGP is the potential target of effector Rip63. This project aims to study the interaction of Rip63 and GGP in planta; any change of the phosphorylase activity of GGP when targeted by Rip63; the accumulation of hydrogen peroxide mediated by Rip63 during R. solanacearum infection. The proposed project will elucidate the molecular mechanism mediated by Rip63 to induce plant resistance, which facilitate to find a new clue for the resistance breeding of Solanaceae crops.

青枯菌侵染茄科植物时能诱导植物产生过氧化氢，是寄主植物抗性水平的一个重要指标。目前，还不清楚青枯菌效应蛋白在抗性寄主产生过氧化氢过程中的作用。前期研究工作发现青枯菌GMI1000效应蛋白Rip63不仅能在非寄主本氏烟上诱导过敏性反应（HR）的产生，而且在GMI1000中过量表达能诱导寄主植物番茄产生抗病反应。酵母双杂交实验显示，Rip63在蛋白水平上与抗坏血酸合成关键酶GDP-L-半乳糖磷酸酶（GGP）互作；VIGS介导的GGP基因沉默也表明，Rip63在干扰植株上诱导HR的时间提前，推测GGP是Rip63的作用靶点。本项目拟进一步研究Rip63和GGP在植物体内的互作情况；Rip63与GGP的互作对GGP磷酸酶活性的影响，以及引起的植物体内过氧化氢浓度的变化。项目旨在阐明效应蛋白Rip63作用于GGP，通过改变植物体内的过氧化氢水平介导植物抗性，研究结果可为茄科作物抗病育种提供新的思路。

茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum侵染至少250余种植物，可造成毁灭性的细菌性青枯病，在世界范围内广泛分布。由于青枯菌群体变异大及其土壤传播的特点，导致化学防治效果不理想，青枯病一直严重威胁着农作物的生产。本项目从可以诱导细胞坏死的青枯菌效应蛋白RipQ（Rip63）入手，发现瞬时表RipQ能够诱导番茄叶片H2O2的大量累积，伴随过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a以及茉莉酸通路标志基因PDF1.2上调表达，表明RipQ具有诱导寄主植物抗病反应的作用。进一步获得了表达RipQ的转基因拟南芥，与野生型相比，转基因植株中的防御基因PR1a和PDF1.2表达量上调，抗青枯病能力显著增强。拟南芥Sid2-1突变体和Coi1突变体不能激活其对青枯菌的抗病反应，表明RipQ诱导的植物抗病反应与水杨酸和茉莉酸途径相关。转基因植株的农艺性状与野生型相比没有显著性变化，表明RipQ的转基因植物有应用前景。.基于以上的研究，我们通过酵母双杂交筛选到了RipQ在植物中的互作蛋白GDP-L-半乳糖磷酸酶（GGP），荧光素酶互补实验及pull-down证明了RipQ与GGP可以在植物体内外互作。进一步阐明了RipQ通过抑制GGP的酶活降低植物体内抗坏血酸的含量，提早植物体内氧爆发的时间，激活SA和JA途径，使植物产生抗病性。因此，本项目阐明了青枯菌效应蛋白RipQ通过作用于植物GDP-L-半乳糖磷酸酶，提高植物体内的过氧化氢水平来增强寄主植物抗性的作用模式，为开展茄科作物抗病分子育种提供新的候选基因。