ERK信号通路介导的海马神经再生在化痰祛瘀方肝豆灵改善Wilson病TX小鼠学习记忆中的作用研究

Wilson's disease, one of the most inherited neurological diseases, is an autosomal recessive genetic disorder, in which copper progressively accumulates in tissues due to defects in copper metabolism. Our previous clinical studies showed that Gandouling, which resolve phlegm and remove blood stasis, could significantly improve the cognitive function of patients with Wilson's disease. Based on our preliminary studies that were sponsored by national youth foundation and literatures, we propose that Gandouling may activate ERK signaling pathways and promote hippocampal neurogenesis, thus leading to improvement of cognitive functions. This project will employ the classic TX mouse model for Wilson's disease to observe the effectiveness of Gandouling in improving the ability of spatial learning and memory，hippocampal neurogenesis（including the proliferation, differentiation and survival） and the formation of synapses in newborn neurons. We will also observe the efficacy to promote the phosphorylation level of ERK. In addition, we will use small molecule inhibitors to block the ERK1/2 signaling pathway in order to validate that Gandouling functions via activation of the ERK signaling pathway in vivo. Furthermore, we will employ the approach of culturing the embryonic neural stem cells together with the serum pharmacological method to reveal the molecular mechanisms by which Gandouling modulate the proliferation, differentiation, and survival of neural stem cells and the formation of neural synapse. Particularly, we will elucidate the roles of ERK signaling pathways during Gandouling treatments. The proposed study will provide solid basis for treating cognitive disorder of Wilson's disease by Gandouling which resolve phlegm and remove blood stasis.

Wilson病是一种常染色体隐性遗传的慢性进行性铜代谢障碍性疾病，是最常见的神经遗传疾病之一。前期临床研究显示化痰祛瘀方肝豆灵可改善Wilson病所致认知功能减退。综合文献，结合前期青年基金研究发现和预实验研究基础，我们提出化痰祛瘀方肝豆灵可通过激活ERK信号通路促进海马神经再生从而改善认知功能。本课题将运用经典的Wilson病TX小鼠模型，观察比较肝豆灵对模型小鼠空间学习记忆能力、海马齿状回神经再生（增殖、分化、存活）、新生神经元突触生成和ERK磷酸化的影响，并利用侧脑室注射工具药阻断ERK1/2信号激活的方法反向证明ERK信号通路在其中的作用。本课题还将利用培养胚胎神经干细胞模型结合血清药理学方法，体外验证化痰祛瘀方肝豆灵对神经干细胞增殖、分化、存活以及新生神经元突触生成的影响，并观察和验证ERK信号通路在其中作用。研究将为化痰祛瘀方治疗Wilson病认知功能障碍提供神经生物学依据。

目的：本课题分为在体和体外研究两方面。在体研究，建立Wilson病模型，观察高铜对海马齿状回细胞病理改变的影响及肝豆灵对Wilson病学习记忆功能的作用和海马齿状回细胞增殖与存活的影响以及ERK信号调节通路的作用。体外方面，建立铜负荷海马神经干细胞培养模型，以海马神经干细胞增殖为切入点，研究肝豆灵对神经再生的影响。方法：在体研究，将Wilson病模型分为空白组、模型组、肝豆灵片组、二巯丁二酸胶囊组、肝豆灵片+二巯丁二酸胶囊组。采用HE染色法观察铜离子及肝豆灵对海马齿状回细胞病理改变的影响，免疫组织化学标记法观察肝豆灵对海马齿状回神经细胞增殖存活的影响。运用免疫印迹法和Morris水迷宫实验观察肝豆灵对模型小鼠学习记忆及细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的影响。体外研究，海马神经干细胞分为3组：正常对照组、铜负荷模型组、铜负荷模型肝豆灵药物血清组。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)掺入法结合免疫荧光标记、甲基噻唑基四唑比色（MTT）实验检测观察神经干细胞的增殖。结果：Wilson病模型组海马齿状回细胞出现明显凋亡特征，肝豆灵组、二巯丁二酸组、肝豆灵+二巯丁二酸组的病理改变轻于模型组，并且药后第28天的齿状回细胞病理改变轻于第7天，肝豆灵和二巯丁二酸均可以促进海马齿状回神经细胞的增殖（P<0.01），肝豆灵和二巯丁二酸联用时可以显著促进海马齿状回神经细胞的存活（P<0.01）。与模型对照组比较，肝豆灵能促进Wilson病模型ERK1/2磷酸化水平（P<0.001），缩短找到水下平台的潜伏期（P<0.05），延长在水下平台的停留时间（P<0.05），肝豆灵+二巯丁二酸效果优于单用肝豆灵（P<0.01、0.001）。体外研究发现，高铜负荷可抑制神经干细胞的增殖，肝豆灵药物血清处理则可明显改善高铜所致神经干细胞增殖的抑制。结论：肝豆灵可能通过促进Wilson病模型小鼠鼠ERK1/2磷酸化水平而改善铜离子对小鼠海马齿状回神经细胞的损伤，促进海马齿状回神经细胞增殖，提高增殖细胞的存活率，进而改善空间记忆功能。体外研究发现，肝豆灵药物血清可以促进高铜培养海马神经干细胞增殖。