全亲水性偶氮苯囊泡探针在食源性致病菌检测中的基础研究

This study is to prepare and modify hydrophilic copolymer magnesium ion probe by graft copolymerization between olefine ester of azobenzene derivative and dextran, and to determine its composition and structure as well as to perform characterization analysis by 1H NMR, (13)CNMR, EIMS, elemental analysis, infrared spectrum, thermogravimetric analysis, X-ray single crystal diffraction, SEM and other analysis methods; to to research its performance of recogniting magnesium ion by ultraviolet spectrum and fluorescence spectra, to investigate the influence of media, pH, response time and other factors on its recognition performance in loop-mediated isothermal amplification (LAMP), to calculate its stokes and emission spectra shift after its response to magnesium ion, and to speculate reasonable magnesium ion recognition mechanism via the vesicle or micellar structures after blue shift induced by magnesium ion as well as density-functional theory. The expected achievements of this study will provide theoretical support and application platform for detection of food-borne pathogenic bacteria, and it is of great social and economic significance.

本研究拟利用偶氮苯衍生物的烯酸酯与右旋糖酐进行接枝共聚，制备含偶氮苯生色基团的全亲水性胶束镁离子探针，并对其进一步修饰改造；利用核磁氢谱、碳谱、质谱、元素分析、红外光谱、热重分析、X-射线单晶衍射、扫描电镜等分析测试手段确定组成及结构并进行表征分析。运用紫外光谱、荧光光谱研究体系对镁离子的识别性能；探索环介导恒温扩增中介质、pH及响应时间等因素对识别性能的影响规律；计算体系与镁离子响应后的Stokes和发射光谱位移；结合镁离子诱导蓝移后的囊泡或胶束结构及密度泛函理论，推测合理的镁离子识别机理。本研究预期成果将为食源性致病菌的环介导恒温扩增检测提供理论支撑和研究应用平台，社会和经济意义重大。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，然而经过十多年的发展，由于其假阳性率高，重复性差，仍停留在实验室研究阶段，未能实际应用。.本项目针对LAMP的技术原理及特点，从根源上查找技术缺陷，寻求改进措施，实现食源性致病菌的现场快速检测。本研究从LAMP的最初报道入手，合成相同的引物，采用相同的反应体系与反应条件进行试验；并且验证了13种食源性致病细菌的LAMP检测研究报道。研究表明限制LAMP技术推广应用的瓶颈并非业界公认的气溶胶污染，而是引物二聚体引发的非特性扩增，采用引物设计与增强剂两种措施有效降低了非特性扩增，通过95℃预变性以及选择16S-23S rRNA intergenic spacer region为靶序列提高了灵敏度。本项目既发现了LAMP的原理缺陷又提出了科学有效的改进措施。.本项目利用偶氮苯衍生物的烯酸酯与右旋糖酐进行接枝共聚，制备了含偶氮苯生色基团的全亲水性胶束镁离子探针，并对其进行了修饰改造；利用核磁氢谱、碳谱、质谱、元素分析、红外光谱、热重分析、X-射线单晶衍射、扫描电镜确定了组成、结构并进行表征分析；探索了LAMP反应中介质、pH 及响应时间等因素对识别性能的影响规律，建立了核酸可视化LAMP检测平台；建立了13种食源性致病菌的20种LAMP可视化检测方法，建立了BAR基因、CaMV 35S基因、PAT基因、FMV35S基因等8个基因的LAMP可视化检测方法，用于检测食品中转基因成分，建立了动物致病病毒Ⅱ型圆环病毒(PVC-2)、猪细小病毒病（PPI）、猪伪狂犬病毒(PRV)的LAMP可视化检测方法，建立了肺炎支原体的LAMP可视化检测方法，规模化的应用试验验证了所建核酸可视化LAMP检测平台的稳定性与有效性。.本项目的研究成果为我国核酸恒温扩增检测提供了理论与技术支撑，为食品行业与医疗卫生行业提供了具有自主知识产权的基因检测试剂盒与装备，社会和经济意义重大。