miRNA-125通过抑制NMD途径增强无义突变所致血友病翻译通读治疗的研究

The frequency of nonsense mutation in hemophilia is approximately 10%. Premature termination codons (PTCs) can be generated by nonsense mutation, and such PTC-mRNAs encode inactive aberrant C-terminally truncated coagulation factors. Read-through drugs promote the combination of near-cognate aminoacyl tRNA and PTC, and induce the partial restoration of full-length protein synthesis. However，the effect of read-through can be reduced by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway according to degrading PTC-mRNAs. In the project, we will construct a cell model of hemophilia caused by nonsense mutation, and analyze the molecular mechanism of miRNA-125 regulating coagulation factor VIII or IX. Subsequently, we will detect the mRNA levels and full-length protein levels of F8/F9 in all treatment groups using qRT-PCR, Western Blot and ELISA. Our research will reveal the molecular mechanism of miRNA-125 enhancing the effect of translational bypass therapy (TBT) and provide insight into novel therapeutic strategies with TBT for hemophilia and other inherited diseases caused by nonsense mutation.

大约10%的血友病由无义突变引起，无义突变导致mRNA中出现提前终止密码子（PTC），蛋白质合成被提前终止，无法产生有活性的凝血因子。促通读药物可通过使近关联氨基酰tRNA与PTC结合，将PTC解码为有义密码子达到一定治疗效果，但无义突变可引发无义介导的mRNA降解（NMD）途径导致mRNA被降解从而严重影响通读治疗效果。本研究通过建立无义突变所致血友病细胞模型，分析miRNA-125对NMD途径的影响，进而揭示其对无义突变的凝血因子调控的分子机制；通过qRT-PCR、Western Blot及Myc/HA双抗夹心ELISA法检测单用促通读药物处理、联合miRNA-125和促通读药物共处理、空白对照组中凝血因子mRNA水平及全长蛋白水平，评价miRNA-125是否能够增强无义突变所致血友病的翻译通读治疗，并揭示其分子机制，为无义突变所致血友病及其它遗传性疾病的翻译通读治疗提供一种新的思路。

凝血因子发生无义突变可导致重型血友病，无义突变使得mRNA中出现提前终止密码子（premature termination codons，PTC），蛋白质合成被提前终止，无法产生有活性的凝血因子。促通读药物可通过使近关联氨基酰tRNA与PTC结合，将PTC解码为有义密码子达到一定治疗效果，但无义突变可引发无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途径导致mRNA被降解从而严重影响通读治疗效果。本项目建立了含无义突变的凝血因子的稳定细胞株和来源于血友病患者的诱导多能干细胞（iPSCs）；稳定细胞株中转染miRNA-125后，凝血因子mRNA水平相比对照组有明显提高，证实miRNA-125能够通过靶向关键蛋白SMG1抑制NMD途径，提高无义突变的凝血因子基因mRNA水平；通过Western Blotting及ELISA检测发现，miRNA-125与促通读药物G418（或PTC124）联合处理后，与单用G418（或PTC124）处理相比，可以得到更多的凝血因子全长蛋白，证实miRNA-125可增强翻译通读治疗的效果；进一步深入研究揭示其分子机制为miRNA-125作为一种NMD抑制剂，能够通过下调NMD关键因子SMG1的表达来抑制NMD途径，使无义突变的凝血因子基因mRNA水平升高，这样使得促通读药物可以作用的mRNA底物增多，更能有效地提高全长凝血因子蛋白的表达。此外，在研究中发现无义突变的凝血因子基因发生了选择性剪接，产生了两种较短的剪接产物Alt-S1和Alt-S2，推测可能是由于无义相关的选择性剪接（nonsense-associated altered splicing，NAS）途径导致。本项目深入研究了无义突变导致血友病的分子机制，为无义突变所致血友病及其它遗传性疾病的翻译通读治疗提供一种新的思路，对遗传性疾病的个体化治疗提供可靠的理论依据和指导意义。