模式识别受体AIM2去乙酰化修饰调控宿主抵御李斯特菌感染的作用机制研究

Listeria monocytogenes, an intracellular pathogen that causes the listeriosis, triggers innate immune responses via pattern recognition receptor AIM2 (Absent in melanoma 2). Upon infection, AIM2 senses L. monocytogenes-derived DNA，and undergoes oligomerization. AIM2 oligomer recruits ASC and procaspase-1, thus form a multi-molecular complex called inflammasome. Inflammasome activation triggers immune responses to control L. monocytogenes infection. However, the mechanism underlying the L. monocytogenes-induced AIM2 activation remains unclear. Since post-translational modifications (PTMs) play a critical role in the activation of pattern recognition receptors such as NLRP3, we wonder whether AIM2 is also regulated by PTMs. In the current study, we identified several PTMs of AIM2 by LC-MS. Mutagenesis analysis showed that the acetylation of Lys85 may suppress the activation of AIM2 inflammasome. To verify this hypothesis, the following questions should be elucidated: 1. how the deacetylation of Lys85 affects AIM2 oligomerization, 2. whether L. monocytogenes infection can downregulate the acetylation of AIM2 at Lys85, 3. which actyltransferase/deacetylase regulate host immunity against Listeriosis. By exploring these questions, our study will not only expand our knowledge of the mechanism of AIM2 activation, but also provide novel therapeutic strategies for treating L. monocytogenes infection.

李斯特菌感染可导致败血症发生。在宿主抵御李斯特菌感染中，模式识别受体AIM2发挥了重要作用，其通过形成炎症小体激活下游免疫反应，清除病原菌。但在此过程中，AIM2的激活机制尚不清楚。已知翻译后修饰是模式识别受体激活的重要调控机制。在前期研究中，申请人系统鉴定了AIM2的翻译后修饰，并发现第85位赖氨酸乙酰化可能抑制AIM2的激活,提示其去乙酰化修饰可能调控宿主抗李斯特菌感染。为验证该假说，申请人拟从以下三方面开展研究：1.研究去乙酰化对AIM2寡聚化的影响，明确该翻译后修饰作用的分子机制；2.制备位点特异乙酰化抗体，探索李斯特菌感染后AIM2乙酰化的变化趋势；3.通过抑制剂或外源共表达等体系，筛选鉴定调控该乙酰化修饰的乙酰转移酶及去乙酰化酶，并研究其对李斯特菌感染的调控作用。通过上述研究，以期全面阐述AIM2去乙酰化修饰调控宿主抗李斯特菌免疫的信号通路，并为治疗李斯特菌感染提供可能的策略。

宿主固有免疫系统对病原微生物的识别依赖于一类称之为模式识别受体的蛋白。模式识别受体黑色素瘤缺失因子2（Absent in Melanoma 2 ，AIM2）可以在胞内识别来源于细菌及病毒的双链DNA，进而通过形成AIM2炎症小体介导宿主的固有免疫反应。因此了解AIM2炎症小体的激活调控机制，将为干预宿主的固有免疫反应提供可能的策略。翻译后修饰是模式识别受体的重要调控机制，为了系统研究翻译后修饰对于AIM2的调控作用，我们构建了四环素诱导调控表达Flag标签AIM2的小鼠巨噬细胞，分别在过表达AIM2及双链DNA刺激等两种激活条件下，通过免疫沉淀AIM2联合质谱的技术手段，检测了包括磷酸化、乙酰化及泛素化等翻译后修饰变化。经研究发现，在AIM2的激活过程中，其第108位丝氨酸发生磷酸化修饰。通过在小鼠巨噬细胞中进行敲除-回补实验，我们对该磷酸化修饰的作用进行了验证。在双链DNA刺激条件下，我们检测了野生型AIM2及S108A、S108D等突变体回补细胞上清中的IL-1β水平，第108位的丝氨酸磷酸化对于AIM2炎症小体的激活存在抑制作用。为了进一步在内源水平明确上述翻译后修饰的变化，我们针对上述修饰位点进行了磷酸化位点特异抗体的制备，并在进一步的研究中，对AIM2第108位丝氨酸磷酸化的内源性变化进行了评价。我们发现随着双链DNA的刺激时间延长，小鼠巨噬细胞中AIM2第108位丝氨酸磷酸化呈上调趋势，提示该位点可能在AIM2炎症小体的激活过程中起到了负向调节的作用。为了寻找AIM2第108位丝氨酸磷酸化的调控激酶，我们构建了含有180种常见激酶的质粒文库，并通过体外HEK293T共表达实验进行筛选，发现ATM/ATR通路的激活可能直接参与了AIM2第108位丝氨酸磷酸化的调控。在进一步的实验中，我们发现李斯特菌产生的溶血素Listeriolysin O能够显著诱导ATM/ATR通路的激活，并进而诱导AIM2磷酸化的发生。该发现不仅揭示了李斯特菌通过抑制AIM2激活进而调控宿主固有免疫的新机制，同时还为相关食源性病原菌感染的治疗提供了潜在的靶标。