基于转录组测序的龙血树中龙血素B生物合成的关键酶基因分离鉴定

Loureirin b, dihydrochalcone compound, is standard component and main active ingredient in Dragon's blood. However, the biosynthetic pathway of loureirin b has not been studied in Dracaena, especially the key enzyme gene. The acyl reductase (ENRL) is a potential key enzyme gene of dihydrochalcone biosynthesis based on the research in apple. In this study, the key enzyme genes of loureirin b biosynthesis will be isolated and identified. Through transcriptome sequencing analysis, the general expression genes and specific expression genes of secondary metabolism will be analyzed in different induction Dracaena. The CDS information of ENRL in Dracaena would be obtained by homologous search of transcriptome data using enoyl reductase enzymes from Arabidopsis, cloning the ENRL genes. Correlation analysis of ENRL gene expression and loureirin b content will be carry out based on qRT-PCR and HPLC. Functional verification of ENRL will be analysis based on Transient analysis, in vitro enzyme activity analysis and overexpression analysis. The aim of this study is to reveal the key enzyme genes of loureirin b biosynthesis, and to clarify the the general expression genes and specific expression genes in Dracaena Under different induction.

龙血素B(二氢查耳酮类)是名贵中药龙血竭的特征成分和主要活性成分，但是其在龙血树中的生物合成信息特别是关键酶基因还未得到揭示。根据苹果中二氢查耳酮代谢的研究，其生物合成途径中的酰烯基还原酶(ENRL)是潜在的关键酶。为此本项目拟分离鉴定龙血树中龙血素B生物合成的关键酶基因。具体内容包括：通过转录组测序分析，揭示真菌诱导、化学诱导、机械创伤诱导龙血树中次生代谢的普遍表达基因和特异表达基因；利用拟南芥酰烯基还原酶基因对转录组数据进行同源搜索得到龙血树中ENRL的CDS信息，利用RACE技术进行ENRL基因全长克隆；基于qRT-PCR和HPLC分析，对不同诱导时期样品的ENRL基因表达量和龙血素B含量进行关联分析；基于ENRL基因的瞬时分析、体外酶活鉴定和过表达分析，进行功能验证研究。本项目旨在揭示龙血素B生物合成的关键酶基因，明确龙血树在真菌诱导、化学诱导、机械创伤诱导下的各自特异性表达基因。

龙血竭由龙血树结脂树干提炼而成，作为一种传统名贵中药已有上千年的使用历史，野生龙血树资源枯竭和龙血竭人工诱导技术研发滞后是当前该产业面临的主要瓶颈，而瓶颈核心是龙血竭主要化学成分及显红色成分的龙血素A/B等二氢查尔酮化合物生物合成途径信息特别是关键限速酶还未得到揭示。基于此进行了以下主要研究内容：设计并实施了简便高效的龙血竭诱导方法，基于诱导样品转录组差异表达基因的功能和通路注释，对上调表达的龙血竭类黄酮生物合成酶基因进行筛选，利用高可靠性的候选基因筛选结果，通过分析诱导样品物理特性、化学成分与基因表达量之间的时空变化关联确认龙血素A/B生物合成的潜在关键酶基因。利用电转打孔方式进行机械创伤诱导和化学试剂诱导龙血竭分泌，具有简便易行、创伤面积大、诱导效率高、不影响植株正常生长发育等优点。利用转录组差异基因的功能注释和通路分析，阐述机械创伤和化学试剂2种方式诱导的次生代谢差异基因主要集中于苯丙烷途径和类黄酮途径，化学试剂诱导样品的上调表达差异基因数高于机械创伤诱导，两者下调表达差异基因数和上下调基因功能型无明显差异。在3种龙血树转录组数据库中均未搜索到ENRL酶基因，为确认龙血素A/B生物合成关键酶基因，利用qPCR和HPLC分析诱导样品PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3′H、DFR基因表达量和龙血素A/B含量，结合提取液红色深浅进行时空变化关联分析研究，明确CHS和DFR为潜在的关键酶。本项目的研究结果有助于探究龙血竭形成的分子机制，为龙血竭高效诱导技术研发应用提供新思路和理论依据。