24nt-siRNA在水稻强弱势粒灌浆充实中的功能及作用机制研究

Poor grain-filling of rice inferior spikelets is a key factor limiting the yield potential of modern rice cultivars, and one important reason is low expression of sucrose and starch synthesis genes. By high-throughput sequencing, it is proved that small RNAs (miRNAs and siRNAs) are involved in regulating gene expression during rice grain filling, but litttle is known about the function and mechanism of siRNAs regulation. From our previous sequencing data, we found 24nt-siRNAs in inferior grains are much more than that of superior grain and more target genes were involved in sucrose and starch biosynthesis pathway. In this study, we intend to investigate the function of 24nt-siRNAs during rice grain filling by using RNAi of key genes (PolIV、RDR2、DCL3) in producing 24nt-siRNAs. Expression of target genes related to sucrose and starch synthesis will be quantified by qRT-PCR, and RLM-RACE and bisulfate sequencing technology will be used to detect the target gene cleavage sites and status of DNA methylation. By explaining the mechanism of how 24nt-siRNA functions, it will be helpful to provide theoretical guide for yield improvement of modern rice varieties by means of molecular breeding.

穗下部弱势籽粒充实度差是现代水稻品种产量提高的关键限制因素，蔗糖-淀粉合成相关基因表达量低是其内在原因。大规模测序已证明有大量的非编码小RNA（miRNA和siRNA）参与水稻籽粒发育相关基因的表达调控，但其中siRNA的功能和作用机制知之甚少。本课题组研究发现，水稻弱势粒24nt-siRNA表达量高于强势粒，而且靶向于蔗糖和淀粉合成相关的基因也远多于强势粒。本项目以RNAi方法抑制24nt-siRNA产生的关键基因PolIV、RDR2、DCL3，采用定量RT-PCR技术检测籽粒中24nt-siRNA靶向于蔗糖和淀粉合成相关基因的表达量，利用RLM-RACE技术和亚硫酸氢盐修饰测序技术检测靶基因切割位点和甲基化状态，以阐明24nt-siRNA对其靶基因调控的作用方式，明确24nt-siRNA在水稻籽粒充实中的功能及其作用机制，为分子改良提高水稻弱势籽粒充实度提供理论依据。

24 nt-siRNAs 是水稻籽粒中数量最多的小干扰 RNA，在水稻强势粒和弱势粒中 24 nt-siRNA 的表达量逐渐降低，但各个时期弱势粒中24 nt-siRNA 表达量都高于强势粒。本研究以新丰 2 号为材料，采用简易 RNAi 构建法分别构建了水稻胚乳特异性启动子 Gt13a 启动的三个干扰载体 DCL3ai、 polIVi 和 RDR2i，得到三类 RNAi 转基因株系T0 代，并对阳性转基因株系目的基因表达量和籽粒表型进行了检测，结果发现转基因水稻籽粒单粒重发生显著性降低（P < 0.05），籽粒变小，长和宽都发生显著性变化（ P < 0.05），说明籽粒中 24 nt-siRNA的变化对籽粒大小及籽粒灌浆有重要影响。.通过亚硫酸盐测序法和 5’RACE 扩增法分别检测了靶基因位点碱基甲基化状态，结果表明强弱势粒间 DNA 甲基化水平存在一定差异。强势粒的 CG， CHG 和 CHH 三类胞嘧啶甲基化水平都高于弱势粒， 其中 CHG和 CHH 类占靶基因总胞嘧啶的 72.5%， 两者甲基化水差异显著（ P<0.05），而强弱势粒间CG 类甲基化水平不存在差异。强弱势粒间 CHG 和 CHH 类甲基化差异是导致 DNA 甲基化差异的主要原因，而弱势粒 24 nt-siRNA 表达量高可能是由于甲基化水平低造成的。.从强弱势粒籽粒小 RNA 靶基因的预测结果中，挑选靶基因LOC_Os06g19990进行 5’RACE 的切割验证。24nt siR180742 与靶基因完全互补，切割点对应siR180742 5’端第 9 和 10 个碱基之间，切割靶基因 LOC-Os06g19990 的可能性最大。因此24nt-siRNA 对基因表达的调控除了在甲基化水平上的调控作用，对靶基因的切割有可能是24nt-siRNA调控网络的另外一条途径。