miR-513c靶向沉默c-met对神经母细胞瘤侵袭转移的影响及机制探讨

Neuroblastoma（NB） is the most common fatal malignant neoplasm in children and is the second most common cause of death for less than 1-year-old children. Tumor invasion and metastasis contribute to the great majority of NB deaths. The relationship of miRNA and tumor invasion and metastasis is becoming hot spot. Using miRNA chip technology, we found that miR-513c low significantly expressed in metastatic NB tissues specimen. On the basis of our previous work, we found that high-invasive NB cells showed the thenotype of low invasive ability through over-expressing miR-513c. By using miRNA target gene prediction softwares, we predicted that c-met was potential target gene of miR-513c. Then we found that c-met high significantly expressed in metastatic NB tissues specimen and miR-513c could suppress c-met in NB cells. So we put forward a hypothesis that miR-513c maybe involve into neuroblastoma invasion and metastasis mediated by c-met. In this study, first of all, we will further clarify the abnormal expression and clinical significance of miR-513c and c-met on the basis of preliminary studies. Secondly, we will use overexpression and knock-down strategy mediated by nano delivery system to explore the mechanism of miR-513c regulating the tumor invasion and metastasis via c-met, in vitro and in vivo. Our study will benefit people a new understanding of the mechanism of neuroblastoma invasion and metastasis, and provide a potential intervention target for tumor invasion and metastasis, and will help us find a new way to reverse the tumor invasion and metastasis of neuroblastoma.

神经母细胞瘤是小儿最常见致死性恶性肿瘤，是1岁以内小儿的第二大致死原因，其侵袭转移是死亡的主要因素。miRNA与肿瘤侵袭转移的关系是当前研究热点，miR-513c是我们前期筛选出的可能与神经母细胞瘤侵袭转移相关的miRNA。预实验发现过表达miR-513c可降低肿瘤侵袭转移的能力；系统生物学提示原癌基因c-met可能为miR-513c的靶标，后续实验证实c-met在转移瘤中高表达、miR-513c可抑制c-met的活性；提示miR-513c可能通过c-met影响肿瘤的侵袭转移。本课题拟在前期研究的基础上深入探讨神经母细胞瘤中miR-513c和c-met的异常表达及其临床意义；借助靶向纳米载体，经过表达、沉默表达和挽救实验等技术进行系统的体内外功能研究，评判miR-513c通过c-met对神经母细胞瘤侵袭转移的影响及其分子机制。本课题具有源头创新，可能为干预神经母细胞瘤的侵袭转移提供新思路。

神经母细胞瘤(NB)是小儿最常见的致死性恶性实体肿瘤。miR-513c可能作为抑癌基因，抑制多种肿瘤的发生发展。谷氨酰胺参与了肿瘤细胞的多种代谢方式，谷氨酰胺酶（GLS）作为关键酶，能够靶向阻断谷氨酰胺代谢。预实验发现GLS可能是miR-513c的潜在靶基因。为了探讨miR-513c和GLS在NB发生发展中的作用，我们首先检测了miR-513c和GLS在NB瘤体组织及其邻近正常组织中的表达。结果显示，miR-513c在瘤体组织中的表达显著下降GSL表达显著升高，两者呈现负相关。我们将miR-513c模拟物转染进入NB细胞中，将miR-513c过表达后，运用划痕实验和侵袭实验检测细胞迁移侵袭能力的变化。结果显示，细胞迁移侵袭和增殖能力显著下降。因此可认为miR-513c不仅是一个有功能的 miRNA，而且能够调控NB细胞的侵袭转移能力。生物信息学预测发现GLS是miR-513c的潜在靶基因之一。为了检测miR-513c是否能够调控GLS的表达，在NB细胞中过表达miR-513c后，Western blot检测GLS的表达，结果显示，miR-513c能够抑制GLS的表达。我们克隆含miR-513c结合位点的GLS的 3’UTR 区，构建含GLS 3’ UTR的萤光素酶报告基因质粒，及其点突变后的对照质粒；而后将miR-513c过表达，分别与上述质粒共转染NB细胞。 萤光素酶活性实验结果表达，miR-513c能够在转录水平抑制GLS的表达。但是，是否miR-513c对GLS产生的这一系列影响就一定能够引起其下游所产生的生物学效应呢？我们构建了特异性靶向GLS的siRNA，来探究下调GLS的表达是否能同样起到抑制NB细胞增值和侵袭的效应。结果显示，siRNA能够显著抑制肿瘤细胞中GLS的表达和谷氨酰胺的摄取率；同时，肿瘤细胞的侵袭迁移能力增值能力均显著下降；另外，CDH1、MMP2和MMP9等与肿瘤侵袭迁移密切相关的蛋白也有相应变化。我们又在miR-513c过表达基础上，过表达GLS（挽救策略）。结果提示，被miR-513c抑制的肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力和增值能力均显著下降均因GLS的过表达被恢复。裸鼠成瘤实验也验证了部分体外实验的结果。综上所述，miR-513c能够通过靶基因GLS调控NB细胞的发生发展。本课题具有源头创新，可能为干预神经母细胞瘤的侵袭转移提供新思路。