冠突曲霉有性产孢新基因的筛选及其功能验证

Aspergillus cristatus is the dominant fungus in the fermentation of Fuzhuan brick-tea. In our early study, we found this fungus formed ascospore and conidia under low and.high osmotic pressure, respectively. In this study, A random insertional transformants library of A. cristatus will be generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Some mutants will be studied in more detail.The flanking DNA sequence of the tagged gene can be isolated from the mutant using inverse PCR. Based on the flanking DNA, the sequence of a mutant gene can be abtained. Then the function of 3-5 new genes will be researched by gene knockout and overexpression techniques. The results of this research will be useful for further studying the sporogenic machinizium, and will provide reference for the study of other fungus such as Aspergillus, penicilium, and so on. On the other hand, These results may help promote the quality of Fuzhuan brick-tea products and the industrialization of brick tea.

“金花菌”-冠突曲霉是茯砖茶发花干燥过程中的优势菌种，其质量和数量作为判断茯砖茶品质优劣的标志，研究发现该菌在渗透压调控下产生无性和有性两个截然不同的世代，该菌可以作为研究产孢机制的良好材料。本研究拟采用根癌农杆菌介导法构建冠突曲霉T-DNA随机插入突变体库，分析突变体的生物特性，筛选产孢缺陷的突变体，利用反向PCR等技术获得突变体的侧翼序列，结合基因组数据得到突变基因的全长序列，利用超表达、基因敲除及互补技术验证基因功能，探索基因与产孢的关系。本研究试图发现新基因3-5个，并进行功能证，该研究的成功可进一步深入研究该菌的产孢机制，理论上可以发现控制产孢的新基因，对其他类似真菌产孢机制的研究具有重要的参考价值。在应用上可控制合适的产孢方式，从而有效控制茯砖茶的质量，对促进茯砖茶的产业化，提高其经济价值具有重要意义。

冠突曲霉（Aspergillus cristatus），有性型为散囊菌，无性型为曲霉，在外界条件诱导下可获得有性和无性两个独立的世代，所以冠突曲霉是研究丝状真菌产孢机制不可多得的典型材料。本研究首次通过ATMT技术构建了较大范围的冠突曲霉T-DNA突变体库，总共获得突变株8865株，筛选出57株表型变异明显的突变株，为进一步开展该菌的功能基因组学研究提够了大量的材料。利用荧光定量PCR技术建立了快速检测T-DNA插入拷贝数的方法，结果发现外源基因多是以单拷贝的形式插入到基因组中的。成功获得了6个突变子插入位点的侧翼序列，初步筛选了3个可能参与产孢调控的新基因。其中突变基因Acmfs会抑制分生孢子和子囊孢子的形成，同时对菌落生长速率起到负调控作用，此外还参与了逆境胁迫应答，这是首次报道MFS转运蛋白参与了氧化压力和低温胁迫应答。突变基因AcndtA在冠突曲霉有性发育早期阶段正调控闭囊壳的发育，对色素的产生可能起到促进作用。突变基因Acz参与调控冠突曲霉响应高渗压，高氧化压力、及色素的合成和分生孢子的产生，但对冠突曲霉产孢结构无显著的影响。本研究首次利用正向和反向遗传学相结合的策略研究调控冠突曲霉生长发育相关的基因，这将对揭示该菌有性和无性孢子形成的机制奠定一定的理论基础。总之，本项目的研究结果为进一步该菌产孢机制的研究提供了很好的技术基础和平台，对其它丝状真菌的产孢机制研究具有很大的借鉴作用。