天山冰川耐冷菌脂肪酶基因的克隆表达及奶油酶解产物特征香气指纹图谱的构建

The project is based on permafrost and melting water from Tianshan mountain No.1Glacier in xinjiang.The present study will screen and identify cold-adapted lipases from psychrotolerants.Combined building rDNA clone libraries and molecular genetic fingerprinting,lipase will be cloned ,expressed and purified.Accordingly,enzymatic properties of recombinant lipase will be investigated. With fresh cream as a substrate for the enzyme solution,the conditions of enzymatic hydrolysis will be controlled and the different characteristic aroma components of enzymolysis products will be collected and analyzed by GC-O and GC-MS coupling techniques and verified characteristic aroma fingerprint informtion by clustering and similarity methods. The characteristic aroma’s fingerprint library from natural milk flavor essence will be constructed and the relevance among enzyme source,enzyme substrates and characteristic aroma compounds will be illuminated.

本项目依托独特的新疆天山1号冰川及冰川融水资源，筛选并鉴定产适冷脂肪酶的耐冷菌，通过构建rDNA分子克隆文库，辅以更简捷的分子遗传学指纹图谱技术，对脂肪酶基因进行克隆和表达，纯化重组脂肪酶，了解其酶学性质；以稀奶油为底物进行酶解，通过控制酶解条件，收集酶解产物，利用GC-O和GC-MS联用技术对酶解产物进行香气成分分析，采用系统聚类和相似度分析法，构建低温条件下酶法制备天然奶味香精特征香气指纹图谱，阐明酶源、酶解底物及特征香气之间的关联性。

本项目依托新疆天山1号冰川资源，筛选能水解奶油产生中、短碳链脂肪酸的低温酯酶产生菌，通过常温常压等离子体（ARTP）诱变、基因工程等技术手段提高酶的产量，并利用现代食品风味分析手段对比分析并鉴定奶制品原料、低温酯酶酶解产物、自制奶味香精及市售牛奶香精的挥发性风味物质，为开发新型低温酯酶酶制剂提供重要的理论依据。主要研究内容及结果如下：.（1）从采自天山一号冰川沉积层的土样和冰川融水样中，分离出377株可培养细菌，通过重复序列PCR技术鉴定后，选取了61株菌落形态特征差异较大的菌株进行革兰氏染色、细胞和形态特性的研究，再经复筛，其中T1-39分解对硝基苯酚丁酸酯（pNPB）活力最强为8.96 U/mL，且被鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.），命名为Pseudomonas sp.T1-39，其16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KP780205。.（2）研究了ARTP快速诱变菌株Pseudomonas sp.T1-39，获得TB1、TB11、D3三株酶活较高的正突变菌株，确定了1株遗传稳定性好、增殖速率快的菌株TB11进行发酵产酶，其酶活力比原始菌株提高了3.45倍。通过产酶工艺的优化得到的酯酶命名为EstTB11，酶活力为58.92 U/mL，是优化前的1.48倍，是原始菌株的6.58倍。.（3）采用硫酸铵沉淀、Q Sepharose FF离子层析和Superdex G75凝胶过滤层析对酯酶EstTB11进行了分离纯化，并在此基础上，对酯酶蛋白的相对分子质量、肽指纹图谱及N-端氨基酸序列进行了分析鉴定， N-端的10个氨基酸序列为GVYDYKNLTT。.（4）通过染色体步移技术并结合EstTB11酯酶的氮端氨基酸序列，从Pseudomonas sp.TB11基因组扩增得到一段长为1848 bp的开放阅读框，编码615个氨基酸；再通过构建重组表达载体，在大肠杆菌Rosetta (DE3)中获得表达，测得酶活力为10.67 U/mL，是原始菌株酶活的1.19倍。.（5）采用SPME-GC/MS和电子鼻检测技术分析了稀奶油、酯酶restT酶解物、诺维信Palatase 20000L酶解物的挥发性化合物，通过两种酶酶解工艺及酶解产物GC/MS图谱的对比分析，表明低温酯酶restT在较低温度下具有较好的水解能力。