阿司匹林改性载BMP-2基因PLGA微球促进骨再生作用研究

It is known that aspirin posses the property of anticoagulation, inhibition of complement activation and inflammatory cytokines. We previously found that BMP gene loading PLGA microspherescan promote bone formation while accompanied by inflammation. Thus, the application of aspirin may improve inflammatory microenvironment of bone regeneration by anti-inflammatory effects . In this study, we will firstly use the double emulsion solvent evaporation method to prepare the PLGA microspheres loading BMP-2 gene, and then modify the microspheres with aspirin by the hydrogen bonds; Scanning electron microscopy and atomic force microscopy will be used to characterize its structure, liquid chromatography analysis techniques will be used to investigate the release of control. The purpose is to screen the best microspheres preparation technique for alveolar bone formation.MTT assay , RT-qPCR, Western Blot will be used to study the effects of aspirin modified gene loading microspheres on proliferation, differentiation and function of BMMSCs under inflammatory microenvironment，in order to clarify the effects and mechanisms of inhibiting inflammation on bone regeneration. Micro-CT, histology and immunohistochemistry techniques will be further used to examine the effects of aspirin modified PLGA@pBMP-2 on rat alveolar bone regeneration after the incisor was removed. This study will lay the foundation for treating Jaw bone destructive diseases using aspirin modified gene loaded microspheres.

已知阿司匹林通过抗凝血、抑制补体激活和异物反应、抑制炎症因子发挥抗炎作用。我们发现载BMP基因微球具有一定促成骨作用并伴有炎症反应，推测炎症反应干扰了其促成骨作用，应用阿司匹林有可能通过抗炎作用改善炎症微环境对骨再生不利影响。本研究首先采用复乳溶剂蒸发法制备载BMP基因PLGA微球，利用氢键作用将阿司匹林修饰在微球表面；通过扫描电镜和原子力显微镜表征其结构，采用液相色谱分析技术探讨其控制释放规律，筛选复合牙槽骨再生需要载基因和载药微球制备技术。通过MTT、RT-qPCR、Western Blot等方法研究炎症环境下，阿司匹林改性载基因微球对骨髓间充质干细胞增殖、分化及功能的影响，阐明抑制炎症微环境对骨重塑作用及机理；采用Micro-CT、组织学和免疫组化等技术，进一步观察阿司匹林改性后载基因微球对大鼠切牙拔除后剩余牙槽嵴骨再生的作用，为应用阿司匹林改性载基因微球治疗颌骨破坏性疾病奠定基础。

前期研究证明载BMP-2基因PLGA微球具有一定的促进骨形成作用，但是作用有限。近期研究报道生物材料植入体内会引起一定的免疫反应，干扰相应的骨形成作用。阿司匹林具有抑制炎症反应的作用，本研究通过在载BMP-2基因PLGA微球表面修饰阿司匹林，研究体内外促进骨形成的作用。.方法：分别以二氯甲烷（DCM组）和乙酸乙酯为溶剂，采用改良W/O/W方法，制备阿司匹林改性载BMP-2基因PLGA微球。检测微球形貌，计算载药阿司匹林的包封率及载药率。在骨髓间充质干细胞培养基中加入LPS模拟炎症环境，分别于3d、7d、14d检测成骨相关基因表达；于21d进行茜苏红染色，分别通过定性及定量分析钙结节形成量。采用大鼠颅盖骨临界骨缺损模型，分别于4w、8w、12w切取大鼠颅盖骨并对其行Micro-CT及组织学分析。.结果：SEM结果显示DCM组阿司匹林改性PLGA微球尺寸大小不一，乙酸乙酯组微球尺寸较小，阿司匹林组微球表面有大量凹陷；乙酸乙酯组微球较光滑。体外两者均呈缓慢释放趋势，累计释放时间分别为38天、22天。Real-time PCR结果显示加入LPS初期（3天），LPS组能够促进骨形成，随着时间的进展，7天、14天时LPS组呈现抑制骨形成作用，加入阿司匹林后能够逆转此抑制作用促进成骨相关基因表达。21天结果同样显示引入阿司匹林后钙结节形成量明显高于LPS组。体内实验正在进行中，数据尚不齐全。.结论：本研究成功制备阿司匹林改性载BMP-2基因PLGA微球；体外研究证实炎症条件下，应用阿司匹林能够明显促进骨形成。