印迹基因TSSC3在骨肉瘤失巢凋亡过程中的分子机制研究

骨肉瘤高发的肺转移率是影响其疗效的主要因素，而获得失巢凋亡抵抗能力是转移一系列步骤中首要的关键步骤。在前一基金资助下，我们利用高密度olig芯片技术筛选出了成骨细胞恶性转化过程中10个差异表达的印迹基因，在对恶性转化的hFOB1.19细胞进行失巢凋亡诱导后，发现其中TSSC3在失巢凋亡抵抗细胞中表达明显下调，用去甲基化药物处理细胞后TSSC3表达呈明显上调且细胞凋亡率也增加。提示该印记基因在骨肉瘤失巢凋亡过程中起重要作用。故本课题拟采用RNAi和真核表达技术，研究沉默或稳定高表达TSSC3基因后骨肉瘤细胞失巢凋亡的变化情况；从而明确TSSC3印记基因在骨肉瘤细胞失巢凋亡中的作用；并利用酵母双杂交技术钓取TSSC3的相互作用蛋白，进一步确定参与TSSC3信号调节的分子机制。研究结果将对深入认识TSSC3印迹基因与骨肉瘤失巢凋亡抵抗的关系，揭示骨肉瘤转移的分子机制具有重要意义。

骨肉瘤高发的肺转移率是影响其疗效的主要因素，而获得失巢凋亡抵抗能力是转移发生的一系列步骤中的首要的关键步骤。我们在前一课题资助下（30371446），检测了成骨细胞恶性转化过程中的印迹基因的表达谱，并发现目前报道的与凋亡相关的唯一的印迹基因TSSC3可能参与了骨肉瘤失巢凋亡的调控。为验证此假设，我们首先检测了骨肉瘤细胞株及组织中TSSC3的表达情况，发现TSSC3在骨肉瘤中表达下调，尤其是失巢凋亡诱导后，呈进行性表达下调。我们通过建立沉默及稳定表达TSSC3的细胞株（SaOS2、恶性转化的hFOB1.19），采用体内及体外实验，研究了TSSC3在骨肉瘤中的作用。发现TSSC3是通过抑制增殖、诱导凋亡而在骨肉瘤的发生发展中起抑癌基因的作用。其诱导凋亡是通过内源性线粒体途径而非外源性死亡受体途径来实现的。这不仅在骨肉瘤细胞株中如此，在骨肉瘤干细胞中也是如此。过表达TSSC3还可以通过诱导凋亡增加化疗药物(顺铂、表柔比星)的敏感性。其诱导凋亡的途径也是通过线粒体途径实现。我们利用酵母栓杂交技术，钓取了TSSC3的相互作用蛋白RANBP9(NM_005493.2)、FLNA（NM_001110556.1）和NCAN（NM_004386.2）。免疫荧光检测发现TSSC3与RUNBP9有共定位，CoIP实验及沉默TSSC3表达发现TSSC3与RUNBP9具有协同促凋亡作用，而且在骨肉瘤失巢凋亡的调控作用中，可能通过FAK/src信号通路起作用。而NCAN可能为一种新的基因，尚有待验证。该研究结果对深入认识TSSC3印迹基因在骨肉瘤失巢凋亡抵抗中的作用，揭示骨肉瘤转移的分子机制具有重要意义。