杂种鹅掌楸均一化cDNA文库构建及生根相关基因筛选

Rooting is an important traits in trees development, so the mechanism of root development has become an important area of the forest breeding research and an important frontier of plant development research. Liriodendron chinese×Liriodendron tulipifera as an important broadleaf tree for industrialcutstock and landscaping was been seriously obstructed the large-scale popularization because it is difficult in propagation particularly taking root in cutting. At the same time Liriodendron species genome information is very scarce, which seriously impeded the research process in reproductive development, growth, and system evolution et al. As adventitious root development in cuttings is a highly complex biological progress, by the basis of crossing breeding in recent years, this project changes the high rooting clones to build a normalized uncut cDNA library of the adventitious root for screening rooting related genes. Further we prepare to clone genes by RACE and functional verification by Real-time temporal and spatial expression differences, in situ hybridization and transgenic technology for investigate the molecular biology of adventitious root formation. The project is aim to provide new ideas and theoretical basis for solving Liriodendron chinese×Liriodendron tulipifera reproduction rooting problem, afford important datas for Liriodendron species genome studies, and offer a viable research way for the study of other species .

生根是林木重要性状之一，根系发育机理研究已成为林木育种研究的重要领域和植物发生发育研究的重要前沿。杂种鹅掌楸是新一代优良用材兼绿化树种，但该树种无性繁殖生根难题至今没有得到根本解决，阻碍其无性系育种和推广应用步伐。同时，鹅掌楸属树种的基因组信息十分匮乏，严重制约其生殖发育、生长及系统进化等研究进程。本项目以我所选育的杂种鹅掌楸高生根率无性系为材料，构建不定根均一化cDNA文库，筛选生根相关基因，并利用Real-time时空表达差异、原位杂交及转基因技术等进行功能验证，探讨不定根发生发育的分子生物学机制，以期为解决杂交鹅掌楸无性繁殖生根难题提供新思路和理论依据，同时为鹅掌楸属树种的基因组学研究提供重要数据，为其他树种的相关研究提供借鉴。

杂交鹅掌楸是新一代优良用材兼绿化树种，但该树种无性繁殖生根难题至今没有得到根本解决，阻碍其无性系育种和推广应用步伐。同时，鹅掌楸属树种的基因组信息十分匮乏，严重制约其生殖发育、生长及系统进化等研究进程。. 本项目在筛选出的杂交鹅掌楸高生根率无性系的基础上，构建高质量的未剪切均一化cDNA 文库，筛选生根相关基因并进行全长克隆，基于不定根解剖学观察，利用 Real-time 时空表达差异和转基因技术等进行功能验证，初步探讨林木不定根发生发育的分子机制。主要结果如下：①利用改良Trizol 法去除高浓度的总糖、总蛋白，提取杂种马褂木不定根发生发育各时期的RNA；②利用Gateway® 入门载体，建立杂种马褂木不定根发生发育阶段的混合的未剪切cDNA文库，利用均一化技术将文库中重复序列拷贝数降低约35-85倍，获得5176条有效EST序列，得到2921个非重复序列，为深入研究杂交鹅掌楸不定根发育的分子机制提供了可用基因信息；③ 通过生物信息学的序列拼接、比对分析，获得37个参与生长素早期响应途径的EST序列，以及多个转录因子、激素合成、信号转导、细胞壁扩张等一批可能调控杂交鹅掌楸不定根发育的基因；④ 对2921条无冗余ESTs序列中2-6核苷酸重复类型的精确型SSR进行检索，开发出181个SSRs，二核苷酸和三核苷酸重复占主导地位，发现重复基序类型具有明显的偏移性，GA/TC、AAG/CTT 基序出现频率非常高；⑤ 通过TAIL技术，获得3个候选ESTs（C03-K04304147-K4147注释的生长素受体TIR1基因，Contig1663注释的RHD以及Contig89序列注释的AUX基因）的基因全长序列， Realtime-PCR结果显示生长素早期响应途径、根毛、转录因子基因在不定根不同发育时期的表达模式具有高度复杂性；⑥ 建立了以模式植物拟南芥和杨树为受体材料的再生体系，以Gateway系统为载体，通过农杆菌介导的方法进行表达载体转化，为进行杂交鹅掌楸不定根发育相关基因的功能验证奠定了良好的基础。. 项目在国外SCI期刊已发表学术论文1篇，SCI期刊接收待刊1篇；国内核心期刊发表学术论文6篇，已接收待刊1篇；出版专著1部；获批高生根杂交鹅掌楸无性系良种3个，授权实用新型1项，申请发明专利1项；培养青年科研骨干1名，博士生1名，硕士1名。