基于人源化体系及肝癌表观遗传修饰异常的β-咔啉类化合物抗癌机制研究

原发性肝癌是全球性健康问题，化疗是肝癌综合治疗的重要手段。肝癌多药耐药性是造成原发性肝癌患者化疗应答率低、生存期短、毒副作用大的主要原因。因而开发新型的具有抗癌特异性、克服肝癌多药耐药性、保护肝功能储备的抗肝癌药物是需要突出解决的关键问题。β-咔啉类化合物在细胞和动物实验中显示了抗肝癌细胞增殖、抑制肿瘤多药耐药、及安全低毒的特征，其药理作用机制的探讨具有重要的科学和应用价值。基于肝癌细胞基因组表观遗传修饰异常, 包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA (miRNA)表达异常,是肝癌多药耐药性和代谢特性改变的主要分子机制，本项目采用表观遗传学检测技术，应用多种肝癌细胞及多药耐药模型，探讨β-咔啉类化合物抗癌、抑制肝癌多药耐药的药理机制；并利用人源化HepaRG系统进一步明确β-咔啉类化合物抗癌特异性、低毒性特征，为抗肝癌药物的开发提供可靠、确实的理论依据和应用基础。

化疗是肝癌综合治疗的重要手段，多药耐药是限制化疗疗效、肝癌复发的重要原因。基于肝癌表观遗传修饰异常的突出特征，选取高效低毒、克服多药耐药的β-咔啉类化合物进行抗肝癌机制研究。采用HepaRG、L02及多种肝癌细胞系为研究对象，评价了目标化合物的抗癌特异性及逆转多药耐药的活性；同时考察了先导化合物对小鼠的急慢性毒性。采用裸鼠移植人肝癌细胞模型评价了化合物的抗肿瘤活性。采用敏感及耐药株为研究对象，以Annexin V/PI法检测先导化合物对肿瘤细胞凋亡作用；以碘化丙啶染色流式细胞术法评价先导化合物对肿瘤细胞增殖周期的影响；采用高内涵成像技术观察了先导化合物对肝癌细胞内氧自由基生成的影响；以Western blotting法检测凋亡相关蛋白、细胞周期调控蛋白、氧化应激调控通路（Nrf2/Keap1、Sirt3/SOD2、NOX/p22phox）的活化；采用RNA沉默及质粒转染方法，分别观察了基因敲除或过表达表观遗传修饰酶Sirt3对肝癌细胞增殖及多药耐药性的影响。采用ChIP-qPCR方法，观察了先导化合物对药物转运蛋白及Ⅱ相酶表观遗传修饰的影响。结果：先导化合物对耐药肝癌细胞增殖的抑制率与敏感株相比无显著差异或更低，尤其在低氧环境中更为显著。先导化合物显著抑制裸鼠移植肿瘤增殖的作用，与氟尿嘧啶相比，具有作用显著和低毒的特点。先导化合物可诱导敏感及耐药肝癌细胞凋亡，与其诱导凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2水平升高、线粒体膜电位降低有关。化合物通过上调p53/p21及下调p-Rb的表达水平使各种肝癌细胞停滞于G0/G1期。化合物活化Nrf2/Keap1、Sirt3/SOD2、NOX/p22phox等氧化应激机制，并对糖酵解途径调控因子HIF1α及关键酶HKⅡ的表达具有显著抑制作用。通过基因沉默及过表达技术，证实 Sirt3/SOD2系统的活化在受试化合物抗癌机制中占主要地位。采用ChIP-qPCR方法发现受试化合物对耐药转运蛋白及II相酶启动子的H3K4me2的修饰具有调控作用。结论：β-咔啉类化合物具有较强的抗癌活性，尤其低氧条件下对敏感及耐药肝癌细胞都具有显著的增殖抑制作用。其机制可能与其诱导凋亡、周期阻滞、抑制糖酵解的作用有关；化合物诱导肿瘤细胞凋亡、抑制糖酵解、克服多药耐药的作用可能与其调控表观修饰酶Sirt3活性和表达水平相关。