基于PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的镇肝熄风法抑制帕金森病氧化应激损伤的机制研究

Liver-yang hyperactivity is the main traditional Chinese medicine pathogenesis of Parkinson's disease (PD), and therapeutical principle of liver-wind suppressing is commonly used for treatment of PD. Dopaminergic neurons injury is the key to pathological, and oxidative stress is the central link of dopaminergic neuron injury in PD. Nuclear translocation of Nrf2 regulated by PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway plays an important role in oxidative stress in dopaminergic neurons. Antioxidant is an effective treatment strategy for PD. In view of previous our findings, we favor the hypothesis that therapeutical principle of liver-wind suppressing inhibits oxidative stress on dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra via PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway, and lead to suppress occurrence and development of the hyperactivity of liver yang in PD. To test the postulation, this project will research effect of Liver-wind Suppressing Decoction on mRNA transcription, protein expression, protein phosphorylation, and nuclear translocation of signal molecule of PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway and gene expression of antioxidant enzyme. The aim of this project is to elucidate the mechanism and target of therapeutical principle of liver-wind suppressing ameliorate the hyperactivity of liver yang in PD. The research results will can provide reliable evidence of pharmacology for clinical medication, and decrease the limitation and blindness of the diagnosis and prescription in traditional Chinese medicine. Thus, this project will expand the scientific connotation of therapeutical principle of liver-wind suppressing.

肝阳上亢是帕金森病的主要病机，镇肝熄风是中医治疗帕金森病的常用治法。多巴胺能神经元损伤是帕金森病的病理关键，氧化应激是多巴胺能神经元损伤的中心环节，而PI3K/Akt/GSK-3β通路调控的Nrf2核转位在氧化应激形成过程中扮演重要角色，抗氧化损伤是防治帕金森病行之有效的途径。我们根据已有研究基础，提出"镇肝熄风法可能通过调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路中的某个环节抑制帕金森病黑质氧化应激，进而发挥对帕金森病肝阳上亢证的治疗作用" 的假说。围绕假说，以镇肝熄风法代表方剂镇肝熄风汤对PI3K/Akt/GSK-3β通路逐级信号分子的mRNA转录、蛋白磷酸化、信号转位及抗氧化酶基因表达的影响为研究主线，以期阐明镇肝熄风法治疗帕金森病肝阳上亢证的作用机制和效应环节，研究结果为临床用药提供可靠的药理学依据，减少传统中医辨证用药中存在的局限性和盲目性，幷进一步丰富中医镇肝熄风法的科学内涵。

多巴胺能神经元损伤是帕金森病（PD）的病理关键，抗氧化损伤是防治帕PD行之有效的途径，镇肝熄风是中医治疗PD的常用治法。本资助项目采用附子汤灌胃联合6-羟基多巴胺（6-OHDA）单侧损毁黑质法复制PD肝阳上亢型病证结合大鼠模型。动物实验研究发现：镇肝熄风汤改善了肝阳上亢型PD模型大鼠易激惹程度、结膜充血、转棒运动潜伏期和旋转行为。镇肝熄风汤抑制肝阳上亢型PD模型大鼠中脑组织细胞凋亡和caspase-3活性、上调酪氨酸羟化酶（TH）蛋白表达、减少了丙二醛含量和活性氧簇（ROS）产生、增加谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值。镇肝熄风汤呈剂量依赖性的增加了肝阳上亢型PD模型大鼠中脑组织蛋白激酶B（Akt）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）（Ser9）磷酸化、上调核转录因子E2相关因子2（Nrf2）基因表达、诱导了II相抗氧化酶血红素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶-1（NQO-1）和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLc）的基因表达。体外实验研究发现：镇肝熄风汤含药血清抑制了6-OHDA诱导PC12细胞死亡和凋亡，减少了ROS产生，降低了脂质过氧化（LPO）水平增加。镇肝熄风汤含药血清上调了6-OHDA处理的PC12细胞中Nrf2基因表达，增加抗氧化反应元件（ARE）荧光素酶活性。镇肝熄风汤含药血清呈剂量依赖性上调了6-OHDA处理的PC12细胞中GCLc、HO-1和NQO1的蛋白和mRNA表达。镇肝熄风汤含药血清呈Akt/GSK-3β通路依赖的抑制了6-OHDA诱导PC12细胞死亡、LPO增加和ROS产生。镇肝熄风汤含药血清增加了Akt和GSK-3β磷酸化水平，镇肝熄风汤含药血清呈Akt/GSK-3β通路依赖的上调了II相抗氧化酶（HO-1、NQO-1和GCLc）蛋白表达，诱导了Nrf2核转位、提高了ARE荧光素酶活性。本资助项目的研究结果阐明镇肝熄风法治疗PD肝阳上亢证的作用机制和效应环节，为临床用药提供可靠的药理学依据。减少传统中医辨证用药中存在的局限性和盲目性，幷进一步丰富中医镇肝熄风法的科学内涵。本项目研究结果发表论文15篇，其中SCI收录论文7篇。