PD-1/B7-HI信号通路在调控NK细胞杀伤对人脑胶质瘤干细胞杀伤效应的实验研究

Glioma stem cells are very small and special cell subsets of glioblastoma multiforme (GBM), withstanding conventional radiotherapy andchemotherapy and having the characteristics of the invasion and metastasis, considered to be the root causes of relapse and treatment resistance of glioma cells. Studies have shown that NK cells (Natural killer cells, NK cells) have powerful anti-tumor effect. Currently, studies have demonstrated that PD-1 molecular highly expressed on activated NK cells， PD-L1 (Programmed death ligand-1 , also known as B7H1) highly expressed on glioma stem cells. But whether the PD-1/B7H1 signaling pathway is invovled in the regulation of NK cells-mediated killing effect on gliama stem cells have not reported. The study will explore the role and mechanism of PD1/B7H1 signaling pathway in modulating the NK cells versus human glioma stem cells, and the results obtained will provide experimental basis for the clinical application of NK cells-based anti-glioma treatment .

多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）中存在仅占极少一部分特殊细胞亚群-胶质瘤干细胞，比分化型胶质瘤细胞能够更好地能耐受常规的放疗和化疗，且具有侵袭和转移性，被认为是肿瘤的复发与治疗抵抗的根源细胞。近年研究显示自然杀伤细胞（NK cells）具有抗肿瘤效应，研究证实激活后的NK细胞高表达PD1受体( programmed death-1，PD1)，胶质瘤干细胞高表达PD-L1（programmed death ligand-1, PD-L1，又称B7H1）分子，但有关PD1/ B7H1信号通路是否参与调控NK细胞介导的对胶质瘤的的免疫应答的研究尚未见报道。本研究将探讨PD1/ B7H1信号通路在调控NK细胞杀伤胶质瘤干细胞中作用的及其机制，为临床应用基于NK细胞的抗胶质瘤治疗提供科学实验依据。

多形性胶质母细胞瘤中存在仅占极少一部分特殊细胞亚群—胶质瘤干细胞(GSCs)，具有高度的侵袭、转移及耐放化疗等特性，被认为是肿瘤的复发与治疗抵抗的根源。近年研究显示自然杀伤（NK）细胞具有抗肿瘤效应，激活后的NK细胞高表达PD1受体( programmeddeath-1，PD1)，胶质瘤干细胞高表达 PD1配体（programmed death ligand-1,又称B7H1）分子，有关 PD1/ B7H1 信号通路是否参与调控NK细胞介导的对胶质瘤的的免疫应答的研究尚未见报道。.本研究利用免疫组化与流式细胞术分析B7H1与PD1分子在胶质瘤组织和肿瘤浸润NK细胞上的表达。将免疫磁珠纯化的人源性异体hNK，通过 IL-2 激活，与分离纯化的人原代胶质瘤干细胞（hGSCs）共培养，通过活细胞免疫荧光示踪技术，检测hNK细胞与hGSCs形成的免疫突触和粘附率，利用流式细胞术检测效应细胞的脱颗粒水平。同时结合Annexin V-FITC/PI双染进行凋亡检测、乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测hNK细胞对hGSCs的杀伤水平。利用 NOD/SCID小鼠构建hGSCs皮下移植瘤模型，鉴定hGSCs的致瘤性。将体外培养hNK细胞多靶点浸润注射于移植瘤瘤内，观察hNK细胞在体内对hGSCs的杀伤功能。 为了进一步观察PD1/B7H1通路对NK细胞在体内杀伤GSCs的调节作用，我们从小鼠胶质瘤细胞系GL261中分离纯化出小鼠胶质瘤干细胞GL261GSCs，构建GL261GSCs的小鼠颅内同种移植瘤模型，给予以小鼠NK（mNK）细胞为主体的过继免疫治疗，通过小动物核磁成像观察mNK细胞对小鼠颅内肿瘤生长的抑制作用。.结果显示：（1）胶质母细胞瘤及GSCs高度表达B7H1分子；（2）IL-2激活的NK细胞其PD1分子的表达水平上调，并且具有杀伤GSCs的活性；（3）单克隆抗体可以阻断NK细胞PD1分子与阻碍靶细胞表面的B7H1分子结合，促进NK细胞对GSCs的杀伤；（4)裸鼠移植瘤动物实验提示，抗 PD1单克隆抗体阻断可以增强NK细胞对肿瘤生长抑制。(5)过继免疫治疗GL261GSCs小鼠颅内移植瘤模型的实验提示， 经抗PD1单克隆抗体阻断的小鼠NK细胞可以有效的抑制荷瘤小鼠颅内肿瘤的生长，延长小鼠的生存期。 .结论： PD1/B7H1信号通路参与负性调控NK细胞对GSCs的杀伤效应。