开发RNA-3C新方法以系统鉴定长非编码RNA体内作用靶标

Human genome encodes over hundreds of thousands long non-coding RNAs, which are more than eight-fold to the number of protein coding genes. Due to technical limits, the functional mechanism for most of the lncRNAs remains unknown. We recently developed a new technique, RNA-3C, to systematically identify lncRNA in vivo targets. By proximity ligation of direct contacting RNAs in situ, we simultaneously identified all the non-coding RNA targets in Hela cell, and largely excluded the false positive signals due to the in vitro ligations by published method. RNA-3C also revealed most of the targets identified by CHART-seq strategy for lncRNA NEAT1 and MALAT1. Unexpectedly, we identified many hub-lncRNAs, which can span over several mega-bases in the same chromosome or across many different chromosome regions. Within this proposal, we are planning to further improve RNA-3C method, and to decipher the functional mechanism of hun-lncRNA in MYC regulation. Moreover, RNA-3C will enable us to reveal new principals, functions and mechanisms for lncRNAs.

人类基因组编码了数十万条lncRNA，是蛋白质编码基因的8倍之多，但由于实验方法的限制，绝大多数lncRNA的功能及作用机制还不清楚。我们近期开发了可鉴定lncRNA靶标的新方法RNA-3C (RNA in situ three-dimensional contacts and conformation capture),借助RNA-RNA的原位连接，实现了非编码RNA靶标的全景式鉴定，并克服了已有方法的体外非特异性连接缺点。RNA-3C重现了NEAT1和MALAT1等已知lncRNA的体内作用靶标，并鉴定了一类hub-lncRNA，它们与周边数个Mb范围内的RNA或者不同染色体上的RNA相互作用，可能在DNA拓扑结构域组织和基因表达调控中发挥重要作用。我们计划继续完善RNA-3C，解析调节MYC的关键hub-lncRNA，揭示lncRNA调控基因表达的新规律、新功能和新机制。

人类基因组经过广泛转录产生了大量的非编码RNA分子，在细胞发育、分化、代谢和癌症发生等过程中发挥着关键的调控作用。非编码RNA，尤其是长链非编码RNA，发挥作用往往需要形成复杂的高级结构，并在RNA结合蛋白的协助下与其他RNA分子相互作用以发挥调控功能。因此，解析非编码RNA的高级结构与作用靶标是理解其功能机制的前提。细胞核内DNA的高级结构可利用Hi-C和ChromEMT等技术进行三维重构，而蛋白质的结构则可利用cryo-EM和cryo-ET等技术加以解析。然而，与DNA和蛋白质结构研究的飞速发展相比，RNA分子原位高级结构的解析则进展缓慢，成为破解生命健康奥秘的瓶颈难题。为了解决该难题，我们在本项目的支持下，创建了RNA原位构象测序新技术RIC-seq，实现了细胞内RNA原位高级结构和作用靶标的全景式解析（Nature 2020，Nat Protocol 2021），并取得了一些重要的概念性进展：1）发现增强子RNA可与启动子RNA互作并介导染色质构象改变，进而调控转录 （Nature 2020, Curr Opin Genet Dev 2021, Essays Biochem 2020, WIREs RNA 2022）; 2）阐明了增强子和启动子非编码RNA在AID靶位点选择中的新功能（Cell Res 2018）；3) 揭示了endo-siRNA以非完全互补配对的方式抑制基因表达的新机制 (Nat Cell Biol 2021)。此外，我们还开发了vRIC-seq技术，用于高通量解析致病性RNA病毒在颗粒内的基因组构象。利用vRIC-seq技术，我们重构了SARS-CoV-2基因组RNA的高级结构，揭示了其结构特征和组织规律，并针对单链暴露区域设计了小干扰RNA，可在细胞内高效切割和清除SARS-CoV-2基因组RNA （Nat Commun 2021）。自2018年本项目执行以来，共发表项目标注的高水平论文四篇，综述四篇，包括Nature、Nature Cell Biology、Cell Research等；申请国内发明专利三项，国际PCT专利一项，获得授权一项，并成功进行了转化应用。在人才培养方面也取得了优异的成绩，造就了一批具有国际视野的优秀中青年科研人才，推动了我国RNA领域的创新发展。