基于mRNA测序的家蚕中肠免疫转录组分析

Intestine plays critical roles in insect immune systems as the front line to confront the invading pathogens. Using fruit fly Drosophila melanogaster as a model, researchers have found that the generation of reactive oxygen species (ROS) and the production of antimicrobial peptides (AMP) through IMD pathway are the main mechanisms in gut immune responses. Little is known about the gut immunity in other insects than fruit fly. It is also unclear so far whether other responses contribute to the defense except AMP and ROS. Taking the advantage of RNA sequencing, we try to analyze the transcriptome of silkworm Bombyx mori midgut after oral infection by feeding of different pathogenic bacteria to identify the differential expressed genes. We will verify the key genes in AMP regulation pathways by quantitative RT-PCR and measure the enzyme activity involved in ROS metabolism. This project will not only define the functions of ROS and AMP in the silkworm gut defense, also will reveal currently unknown pathways or mechanisms in gut immune responses. The silkworm gut immune transcriptome will provide phylogenetic comparison of gut defense mechanisms between silkworm and fruit fly. It will give us some clues for the functional study of key molecules in the insect intestine immunity as well.

肠道作为阻止病原物入侵的第一道防线在昆虫天生免疫中起着重要的作用。以果蝇为模式，利用分子遗传学手段研究发现活性氧反应和通过IMD途径产生抗菌肽是肠道中的主要防御反应机制。但对于其它昆虫的肠道免疫机制，则所知很少。对于是否存在除活性氧和抗菌肽之外的其它免疫机制也不清楚。本项目以家蚕为研究对象，利用RNA-Seq技术，分析家蚕在不同类型细菌感染后的中肠转录组变化，鉴定差异表达基因，利用qRT-PCR对抗菌肽诱导信号途径的关键基因进行验证，测定活性氧反应机制的关键酶活性，从而明确活性氧和抗菌肽在家蚕肠道免疫中的作用，揭示家蚕肠道防御反应的机制，并确立与果蝇肠道免疫机制的进化关系，为肠道免疫系统关键分子的功能分析及机理研究提供线索。

肠道是昆虫抵御病原物入侵的第一道防线。活性氧(ROS)反应和通过IMD途径产生抗菌肽(AMP)是果蝇肠道中的主要防御反应机制。家蚕已成为昆虫遗传学及生物化学研究的模式昆虫。本项目利用RNA-Seq技术，通过转录组分析发现细菌感染刺激家蚕肠道能量代谢增强，并且不同细菌感染诱导家蚕幼虫中肠呈现不同的转录。通过qRT-PCR、ROS及NO浓度测定、肠道内细菌数目统计以及肠道内消化液抗菌活性等验证实验，证实家蚕肠道内ROS在细菌感染前期扮演着清除入侵细菌的角色，而在感染的后期AMPs 扮演着清除肠道内细菌的角色。同时我们还发现，与果蝇不同，Toll途径可能参与家蚕中肠免疫反应。在转录组分析中，我们发现了几个免疫相关关键分子。通过生物化学手段，我们证实：家蚕Serpin-5抑制抗菌肽通路及酚氧化酶原(PPO)激活通路；PGRP-S5负调控家蚕抗菌肽通路；Ferritin 1通过限制家蚕体内铁离子抑制入侵细菌的增殖；Oxidation resistance 1 通过JNK通路参与对细菌感染的防御反应；Peroxiredoxin 5 可以保护家蚕免受细菌感染引起的氧化胁迫。本研究明确了活性氧和抗菌肽在家蚕肠道免疫中的作用，揭示了家蚕肠道防御反应的基本机制，分析了家蚕免疫关键分子的功能，为我们解析家蚕免疫防御反应的详细机理奠定了很好的基础。