建立高通量、高灵敏度 On-line SPE-LC-MS/MS 独角金内酯定量分析方法的研究

Strigolactones (SLs) are a novel class of plant hormones, which act as inhibitors of plant branching and regulate other physiological processes such as root growth, as well as induce seed germination of root parasitic weeds and hyphal branching of arbuscular mycorrhizal fungi. All of these indicate that SLs possess important application prospect in regulation of plant growth and architecture. So far, researches on the biosynthesis, potential final bioactive form, transformation of bioactive forms and metabolism and signalling of SLs still remain unambiguous. Quantitative analysis of SLs has great significance to the elucidation of the physiological roles of SLs. However, the current methods are questionable in many aspects, such as large plant tissue consumption, multi-step and labor-intensive. Focusing on the key technologies and procedures of ultra-micro analysis of SLs，this project will explore and optimize an efficient and manageable purification strategy of SLs through automated on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry（On-line SPE-LC-MS/MS）.The aim of this project is to improve the stability and sensitivity of quantative analysis results of SLs in rice. The implementation of this project will provide reliable technical support and important clues for understanding the biosynthetic pathway and signal transduction of SLs.

独角金内酯（Strigolactones，SLs）是新近发现的一类內源性植物激素，能够抑制植物分枝并调控植物根的生长等生理过程，同时还具有促进寄生植物种子萌发和共生真菌菌丝生长的作用，在调控植物株型和生长发育等方面具有重要的应用前景。目前，SLs的生物合成途径、活性形式、代谢和信号转导等方面还有很多未知问题有待研究，因此能够准确定量分析植物中的SLs 对于阐明这些问题具有非常重要的意义。然而，目前通行的SLs类化合物分析方法存在材料消耗量大、周期长、步骤复杂等问题，特别是在植物样品前处理方面。本研究使用在线固相萃取技术，建立全自动的SLs分离纯化方法，并结合色谱质谱联用技术，建立水稻中高通量、高灵敏度SLs On-line SPE-LC-MS/MS分析方法，以解决其分析方法稳定性差和灵敏度低的问题。通过该方法在植物材料中的应用，为SLs分子作用机理研究提供技术支撑和重要线索。

独角金内酯（Strigolactones, SLs）是一类新型植物激素，能在极低浓度下显著促进寄生植物种子的萌发，促进丛枝真菌分支，并且具有抑制植物侧枝生长的功能，是近年植物科学领域的研究热点之一，因此SLs定性定量分析方法的建立对于阐明其合成代谢通路及分子作用机理具有非常重要的意义。目前SLs类化合物的分析方法主要包括生物鉴定法和液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）分析方法，其中，LC-MS/MS技术具有特异性强、灵敏度高等特点，是SLs定性和定量分析的有力工具。但是现有的分析方法往往是按照前处理纯化和分析检测多步骤、人工操作程序进行的，存在材料消耗量大、周期长、灵敏度低、稳定性差等问题。.本项目基于在线固相萃取（On-line Solid Phase Extraction, On-line SPE）与LC-MS/MS联用技术，建立了水稻中新型植物激素独角金内酯epi-5DS和人工合成类似物GR24的定量分析方法。方法用乙酸乙酯液液萃取植物根系分泌物后，由自动化on-line SPE系统完成对epi-5DS和GR24的富集与纯化并直接完成色谱分离与质谱检测的程序。方法学考察结果良好，两种SLs线性相关系数（R2）大于0.99；epi-5DS、GR24的LOD（S/N=3）分别为0.003 ng/mL与0.015 ng/mL；日间和日内精密度RSD值均小于15%；epi-5DS在低中高浓度下回收率范围是61.31%-76.47%，GR24的回收率在90%左右。将开发的方法应用于水稻野生型和突变体根的分泌物与根组织中epi-5DS的分析，定量分析结果与材料的遗传学背景非常吻合。相对于已有的方法，On-line SPE-LC-MS/MS SLs定量分析方法具有样品前处理操作简便、分析重现性好、分析速度快及材料用量少等优点。本方法的建立给SLs生物合成及作用机理研究提供了重要的技术支持。