拟南芥SDB基因克隆及其参与叶酸代谢调控的分子机理研究

Folates play important roles in regulating several metabolic pathways such as C1 metabolism and the biosynthesis of nucleic acid and amino acid in plants. Folate deficiency and folate homeostasis has great impact on plant growth and development. Up to now the biosynthesis pathways of folate have been extensively investigated, but the molecular mechanism regulating folate metabolism has remained largely unclear. We previosuly identified the Arabidopsis dfb mutant, which is defective in the plastid-localized folylpolyglutamate synthase DFB gene for a key enzyme involved in folate biosynthesis. The dfb mutant had great changes in folate content and folate components and was more sensitive to low nitrogen stress. In order to explore the regulatory mechanisms of DFB function, we screened for dfb mutant supperssors and one of the suppressor, sdb (suppressor for dfb) was identified. Folate content and phenotype were restored to wild type level in the sdb mutant. In this project, SDB gene will be cloned and its expression pattern and protein subcellular location will be characterized. The sdb single mutant and SDB overexpression materials will be obtained, and the relationship of SDB and DFB will be analyzed. Furthermore we will perform transcriptomics analysis of sdb/dfb/wild type to explore its regulatory mechanism on folate metabolism. This study will shed new light on the molecular mechanism of folate metabolism and construction of the folate regulatory network.

叶酸参与植物一碳代谢及核酸、氨基酸合成等许多重要生物学过程，它的缺乏或代谢稳态的变化会影响植物生长发育。尽管植物叶酸合成代谢较为清楚，但其代谢调控的分子机理鲜有报道。本项目前期工作发现，拟南芥叶酸合成关键酶－叶酰聚谷氨酸加尾酶突变体dfb的叶酸含量和组分发生明显变化，生长发育异常及对低氮胁迫敏感。为深入理解何种生物学途径/因子与DFB互作，我们筛选获得了dfb抑制突变体sdb (suppressor for dfb)，其叶酸含量和表型恢复至野生型水平，说明SDB有效参与了叶酸代谢调控。本项目旨在克隆SDB基因，明确其时空表达模式及蛋白亚细胞定位等分子特征，分析sdb单突变体及过表达植株表型及叶酸代谢变化，阐明SDB生理生化功能，分析SDB与DFB的作用关系，对sdb、dfb进行转录组分析，解析SDB介导的调控途径。以上研究将为深入理解叶酸代谢调控机理及叶酸代谢调控网络构建提供理论基础。

叶酸（folates）属于水溶性维生素B族，在维持机体正常生命活动中发挥着重要作用。植物自身能够合成叶酸，近来的研究发现叶酸代谢紊乱会引起植物生长发育的异常。本研究以拟南芥野生型和叶酸聚谷氨酰化酶突变体dfb为主要研究材料，旨在揭示叶酸代谢调控及其影响植物生长发育的分子机制。取得的对今后工作具有指导意义的研究结果如下：1）研究中我们通过将野生型和dfb突变体幼苗进行嫁接实验，发现当将野生型的地上部分与dfb根部结合时，嫁接成功后的幼苗主根开始恢复生长，侧根的生长受到抑制，而将dfb的地上部分嫁接到野生型幼苗的根部发现嫁接成功的幼苗主根发育缓慢，出现同dfb突变体类似的表型。这些现象表明DFB或叶酸在地上部分参与的代谢活动调控了根部的发育。2）为进一步揭示上述现象的分子机制，我们制备了叶酸探针，通过与拟南芥叶片蛋白孵育从而获得细胞内与叶酸发生直接或间接作用的蛋白。我们获得了348个可能与叶酸相互作用的蛋白，包括已经报道的参与叶酸介导一碳代谢的酶，如丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）、甘氨酸脱羧酶（GDC）、甲硫氨酸合成酶（MS）、甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）等。同时获得一些新的叶酸结合蛋白，分别分布在质体、线粒体、细胞质等亚细胞器，参与的代谢途径主要包括三羧酸循环途径、卡尔文循环途径及谷氨酸代谢等。3）拟南芥中含有三个叶酰聚谷氨酸加尾酶同源蛋白DFB、DFC、DFD，分别定位于质体、线粒体和细胞质。三个基因的单突变体中，dfb突变体的表型较为明显，表现为主根缩短、对低氮胁迫更加敏感。鉴于DFB蛋白主要分布在质体中，我们在获得的蛋白数据中将质体定位的蛋白进行了进一步的分析，通过大肠杆菌体外诱导表达和纯化，验证纯化后的蛋白与叶酸的结合能力。. 上述研究结果将有利于帮助我们较为全面的理解叶酸在植物机体内参与了哪些代谢途径，有利于解析叶酸是如何参与这些代谢途径的，从而为了解叶酸参与的代谢途径及叶酸代谢对植物生长发育的调控机制奠定基础。