CRISPR/Cas9技术构建sT2细胞系筛选猪源病毒SLA-I限制性CTL表位的研究

TAP genes are mainly in charge of transporting endogenous peptides to MHC class I and then the MHC I-peptides complex will be formed followed by being presented to the surface of the cell membrane. If the TAP genes were deficient, the presentation for endogenous peptides will be blocked. Then, exogenous peptides can be used to study their presentation in cell, so the viral peptide epitope can be screened. In this research, the porcine kidney cell line PK-15 was selected as target materials to knock out TAP1 and TAP2 genes by using CRISPR/Cas 9, finally to construct a TAP1 and TAP2 (-/-) PK-15 (sT2) cell line. Peptide epitopes derived from swine virus restricted by SLA-I were predicted and synthesized, and then the peptides were pulsed onto normal sT2 cell line and special sT2 cell line with an exogenous SLA-I transferred. Detection of the SLA-I-peptides complexes expression on the cell membrane for sT2 cell lines and exogenous SLA-I transferred sT2 cell line by using SLA-I monoclonal antibody labeled with FITC, comparing to the normal PK-15 cell, the candidate CTL peptide epitopes derived from swine virus bound with SLA-I will be identified indirectly. Finally the peptides’ CTL activity will be detected with ELISPOT and Tetramer assay. This research will construct a cellular platform to screen SLA-I restricted CTL epitopes derived from swine virus and it will break out the restriction of SLA-I for cell itself. Furthermore, this research will pave the way to develop multi-epitopes vaccine to defend swine viral disease later.

TAP基因在细胞内主要负责转运内源性抗原肽给MHC I，形成MHC I-peptides复合物递呈到细胞表面。如果将TAP基因缺失，将阻断内源性多肽的递呈，从而可以专门研究外源性多肽的递呈，以筛选病毒多肽表位。本研究以PK-15细胞为原料，通过CRSPR/Cas9技术敲除TAP1和TAP2基因，最终建立 TAP1和TAP2(-/-)PK-15(sT2)细胞。设计并合成猪源病毒 SLA-I 限制性多肽，分别负载sT2细胞和已转染外源SLA-I分子的 sT2 细胞，SLA-I 荧光标记单抗检测细胞表面SLA-I表达情况，与正常PK-15细胞比较，可间接检测细胞系及外源 SLA-I 所结合的病毒多肽表位。ELISPOT和Tetramer验证多肽表位的活性。本研究将建立SLA-I限制性猪源病毒CTL表位细胞系筛选平台，并突破细胞系本身SLA-I分子的限制性，为今后猪源病毒多表位疫苗的研制奠定基础。

CTL表位是由主要组织相容性复合体（MHC）I类分子结合并被细胞递呈到细胞表面，能刺激CD8 T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL），然后分泌细胞因子从而杀死被病毒感染的靶细胞的一类有功能的多肽。病毒感染细胞后产生的CTL表位均为内源性的表位。内源性多肽表位在递呈过程中需要经过抗原加工相关转运体（TAP）的转运。最新的研究发现，MHC I类分子既可以递呈内源性抗原肽，也可以递呈外源性抗原肽。如果将TAP基因敲除，细胞就只能递呈外源性的抗原肽，从而可以建立体外筛选病毒CTL表位的系统，筛选细胞自然递呈的CTL表位。目前，这样的体系在人和小鼠已经建立，称为T2细胞系，而在猪源病毒CTL表位的筛选方面还缺乏这样的系统。.本项目根据目前的研究现状，结合自己的研究基础提出利用CRISPR/Cas9技术构建猪的T2细胞（sT2）系，并用以筛选猪源病毒SLA-I（猪的MHC I类分子）限制性的CTL表位的设想。该项目以PK15细胞为研究材料，利用CRISPR/Cas9技术成功将PK15细胞系的TAP2和TAP1基因先后敲除，经过传代，细胞系稳定，达到预期目的，获得sT2细胞系。研究还发现，sT2细胞本身表达的SLA-I类分子显著下降。在此基础上，课题组将荷包猪等SLA-I类分子功能基因分别构建真核表达载体，通过慢病毒包装产生缺陷型病毒粒子感染sT2细胞，成功构建了多个表达外源SLA-I类分子的sT2细胞系，并筛选了口蹄疫病毒和非洲猪瘟病毒设计的病毒表位肽。结果发现，构建的细胞系能够快速、准确筛选表达特定SLA-I类分子限制性的病毒CTL表位，而且优势表位经ELISPOT检测证明具有活性，可作为潜在的表位疫苗研究材料。该项目成功构建了猪源病毒CTL表位的细胞系筛选平台，为今后猪源病毒CTL表位疫苗的研究奠定了基础。