家白蚁唾液腺来源关键生物预处理酶的识别及其作用机制初探

The termite system, which is an ancient and highly evolved lignocellulose degrading system on the earth, is believed to hold great promise for bioenergy research. And enzymes secreted from the salivary glands of termites are considered to play an important role in biological pretreatment, which facilitate the hydrolysis and fermentation of lignocellulose in the hindgut. Hence, this study will focus on the discovery of important biomass pretreatment genes from Coptotermes formosanus through comparative analysis of salivary gland-specific transcription profiles from different feeding plans, employing the sequence information of RNA-seq. Subsequently, these candidate genes (probably laccases, phenol oxidizing enzymes, feruloyl esterases coding genes and et al.) will be expressed in Escherichia coli or Pichia pastoris and the resulted enzymes will be purified and characterized. The biological pretreatment functions will be identified by quantifying the synergistic effects of these enzymes in combination with native hindgut-sourced cellulases or commercial cellulases. Meanwhile, specific gene expression will be silenced by feeding termites with homologous dsRNA and the physiological functions of the corresponding enzymes in the digestive process will be determined. The results and conclusions will help to demonstrate the functions and mechanisms of salivary glands-sourced enzymes in lignocellulose digestion and might build new theory for efficient degradation of lignocellulose.

白蚁系统是地球上一种古老的、高度进化的木质纤维素降解系统，在生物质能源领域具有巨大的应用潜力。白蚁唾液腺来源的酶被认为可能具有生物预处理作用，以便木质纤维素在后肠的水解与发酵。因此，本研究拟从家白蚁唾液腺总RNA的RNA-seq深度测序结果中通过比较转录组的方法寻找对木质纤维素的生物预处理起关键作用的酶。接着将这些酶（初步预计为漆酶、酚氧化酶或阿魏酸酯酶等酶）在大肠杆菌或毕赤酵母中进行表达、蛋白纯化及酶学特性分析；并根据其在具体酶解过程中与不同来源糖苷水解酶的协同性，研究这几种组合酶对木质纤维素的预处理作用与机制。同时，利用喂食同源dsRNA干扰目的基因表达的方法研究这几类基因对白蚁消化功能的影响，从而探明这几种酶在白蚁降解木质纤维素过程中的作用。研究结果和结论将有助于从机理上阐明白蚁唾液腺分泌酶在木质纤维素降解过程中的作用机制，从而为实现木质纤维素的高效降解提供新的理论依据。

白蚁系统是一种高效的生物质转化系统，其对木质纤维素的高效生物预处理机制亟待发现。我们通过对家白蚁唾液腺的RNA-seq高通量转录组测序，发现唾液腺不仅分泌一系列水解性的纤维素酶、半纤维素酶而且分泌一些具有木质素修饰作用的氧化还原酶与酯酶。这说明唾液腺这一分泌消化酶的器官不仅参与木质纤维素的水解，而且涉及木质素的修饰这一生物预处理过程，是白蚁系统中一个非常重要的消化器官。..从转录组中我们发现了一个漆酶基因lac1，并在昆虫细胞中实现了异源活性表达。该酶是一种酚氧化型漆酶，在弱酸性条件下对2,6-二甲氧基苯酚具有明显活力，但是不能氧化藜芦醇等苄醇类底物。这一点与Coy 等人（doi:10.1016/j.ibmb.2010.07.004）报道的近缘白蚁Reticulitermes flavipes来源的两个漆酶的酶学特性类似。然而不同的是，Lac1的活力不依赖于H2O2，而文献报道的两个漆酶均依赖于H2O2，暗示了文献报道的漆酶功能的发挥可能需要氧化酶协助（后者可产生H2O2），而Lac1则不需要，可以独立发挥其生物预处理功能。..我们又从白蚁肠道组织（含唾液腺）中分离纯化出了一种主要的氧化还原酶，经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定为血蓝蛋白，命名为Hemo1。Hemo1在酸性与弱酸性条件下对木质素模式底物邻苯二酚、藜芦醇具有一定活力，对漆酶常用底物ABTS也具有较强的活力。此前King等人（doi: 10.1073/pnas.0914228107）预测血蓝蛋白在蛀木水虱中可能发挥对木质素的修饰作用，我们的研究则证实家白蚁中的一种血蓝蛋白Hemo1的确具有木质素修饰活力，是一种新型的生物预处理酶。..阿魏酸酯酶也是一种生物预处理酶，它可以打开木质素与半纤维素之间的酯键，从而分离木质素与半纤维素。我们从家白蚁转录组中确实找到两种被预测为分泌型的酯酶基因，但是在大肠杆菌及毕赤酵母中未能实现活性表达。然而，我们从家白蚁的肠道中筛选到六类产阿魏酸酯酶的细菌，并克隆出其中一株伯克氏菌的功能基因，进而在大肠杆菌中实现了异源表达。白蚁肠道共生微生物来源的阿魏酸酯酶可以与宿主功能互补，发挥生物预处理功能。..综上所述，本研究表明家白蚁唾液腺既分泌纤维素、半纤维素水解酶又分泌生物预处理酶，在白蚁消化生物质的过程中发挥着重要作用。