裸仁美洲南瓜（Cucurbita pepo L.）种皮发育PAL基因克隆及其功能分析

裸仁美洲南瓜(Cucurbita pepo L.)是自然界中罕见的一种变异类型。我们在前一个项目的研究中发现，裸仁美洲南瓜与有壳美洲南瓜相比，在种皮木质素含量、PAL酶活性及PAL基因的表达时间和表达量上有很大差别，由此证实了PAL基因在种皮发育过程中所具有的重要的调控作用。本研究拟以美洲南瓜高代自交姊妹系04LAg-26-2（有壳）和04LAg-26-28（无壳）为试材，进行美洲南瓜PAL基因的克隆，利用生物信息学手段、GFP方法、RNAi技术等技术进行PAL基因功能研究。研究结果对于阐明PAL基因表达特性，丰富次生代谢产物的调控理论，提示木质素生物合成途径的基因表达调控机制具有重要意义；同时，对克隆的PAL基因进一步利用植物表达载体进行遗传转化应用研究，可创造无壳南瓜新种质，从而为拓宽南瓜裸粒种质资源，提升裸粒南瓜种质创新能力奠定基础。

以有壳和裸仁美洲南瓜为试材，利用RACE技术克隆了种皮PAL基因的全长序列，并对其生物信息学进行了分析；采用Real-time PCR技术和生理生化测定，对有壳和裸仁美洲南瓜不同发育时期不同组织部位PAL基因表达特性及PAL酶活性进行了研究；采用基因枪法将构建的重组质粒pCAMIBA-PAL3-GFP和pCAMIBA-PAL13-GFP转入洋葱内表皮细胞，明确了PAL3和PAL13基因编码蛋白在植物细胞中的表达位置；以有壳美洲南瓜种皮PAL基因中部分靶标序列作为干扰片段，构建了由CaMV 35S启动子驱动的具有“正义基因片段pal(f)-pdk intro-反义基因片段pal(r)”的植物干扰表达载体pCEPSPS-FPR。同时研究了接种病原菌后，不同抗性美洲南瓜植株各个部位PAL基因的表达水平。另外，对木质素生物合成中起重要作用的CCR基因进行了克隆，构建了由CaMV 35S启动子驱动的具有“正义基因片段ccrA-pdk intro-反义基因片段ccrB”的植物干扰表达载体pCEPSPS-PgAIB，并对该基因的组织表达特异性及与抗白粉病之间的关系进行了研究。发表研究论文3篇，培养博士研究生1名，硕士研究生3名。本项目研究结果对于阐明美洲南瓜种皮PAL基因表达特异性、揭示控制木质素生物合成途径中相关基因的调控机制和美洲南瓜裸粒品种形成原因，以及对提升裸仁南瓜种质创新等方面具有重要意义。